人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定-论文.pdf

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1、中国组织工程研究第侣巷第24期2014—06—11出版ChineseJoumalofTissueEngineeringResearchJune11，2014Vo1．18,No．24WWW,CRTER．org人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定栗炳南，李卫东，林俊堂，丰慧根，原志庆(新乡医学院生命科学技术学院，河南省新乡市453003)文章亮点：在基因治疗中，联合应用多个具有协同作用的治疗基因通常可产生较单基因更为理想的效果。利用内部核粟炳南，男，1983年生，糖体进入位点构建关于人白血病抑制因子与血管内皮生长因子165双基因共

2、表达基因治疗载体的研究至河南省新乡市人，汉族，2011年中南大学湘雅医今尚未见报道。实验旨在采用一种简便和高效的方法构建双基因共表达载体plRES2．LIF．VEGF165并对学院毕业，博士，讲师，其进行鉴定。主要从事神经系统疾病的关键词：发病机制与治疗方面的研组织构建：组织I程：白氲病捅翻因子：瞧管肉皮生长西予165：奏核双表达载体：内部核糖体进入位点：究。转染}双PCR并列第一作者：李卫东，主题词：、男，1987年生，河南省驻自瞧病抑翻因子：盘管内安生长函子类转染；聚合酶链反直马店市人，汉族，新乡医基金资助：学院生命科学技术学院在颓乡医学院重点领域招标~(

3、ZD2011-：洞南省教育厅科学技术研究重点项s(13A18085~：新乡医学皖读硕士，主要从事脊髓损科磅培育基金【2013QN1111：赣乡医学院碛究生科研新支持计粕项目(YJSCX201231洞南省重大科技伤的基因治疗研究。攻关项g《1221o1310100)}河南省省院科技合作项目I1021o6o0oo17)共同资助，通讯作者：栗炳南，博士，缩略语：讲师，新乡医学院生命科a血病抑魏因子：leukemiainhibitoryfactor,LIFt盘管内皮生长函子165：vascularendothelialgrowthfactor学技术学院，河南省新乡76

4、5，vEGF165市453003doi：103969／jissn2095-4344摘要201424017背景：人白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用。病【http：／／www,crter．org1毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。中图分类号：R318目标：构建双基因共表达载体plRES2．LIF-VEGF165并对其进行鉴定。文献标识码：B方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因，然后文章编号：2095

5、-4344将人自血病抑制因子的cDNA片段插入到plRES2EGFP多克隆位点构建成为plRES2．LIF。EGFP。人血(2014)24-03870-08管内皮生长因子165cDNA片段是通过双PCR的方法从plRES2VEGF165．EGFP质粒中获取，接着将稿件接受：2014—05．03血管内皮生长因子165cDNA片段以替换EGFP的方式插入plRES2一LIF．EGFP中，最后构建成为含有IRES(~P内部核糖体进入位点)的plRES2．LIF—VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK29

6、3细胞，利用RT．PCR与Western．blot方法检测双基因的表达。结果与结论：DNA测序显示，提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，片段大小分别为609bp和576bp。构建的plRES2．LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRIIBamHI切出LiBing-nan，PhD．，Lecturer,LIF条带，经BamHI／Notl双酶切后切出IRES-VEGF185片段，经EcoRI／Notl双酶切后切出DepartmentofLifeSciencesLIF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR与Wester

7、n-blot方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达andTechnology，Xinxiang人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165mRNA和蛋白。结果证实，实验成功构建了人白血病抑制因子和MedicalUniversity．Xinxiang血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。453003，HenanProvince，China粟炳南．李卫东．林俊堂丰慧根踉志庆／t自盘痍劫子和血管内受生长因子165双基因真核表达载钵LiWei-dong，Studyingfor的丰勾建s鉴定中国组织I程磺究．2014．18(24)：3870-3877．ma

8、ster’sdegree，Depart