三叶因子2基因真核表达载体的构建论文

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1、三叶因子2基因真核表达载体的构建论文张绍荣，杨晓强，邢锐，宋于刚，陈学清【关键词】胃溃疡ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofhumanTFF2gene【Abstract】AIM:ToconstructaeukaryoticexpressionvectorofhumanTFF2gene.METHODS:Teasyvector.Thepositivecoloniesedbyrestrictionenzymedigestionandsequencingandthenedigestionandseque

2、ncing.RESULTS:AfterTAcolonofsyntheticTFF2,thepositivecoloniesanTFF2genehasbeensuccessfullyconstructed,.freelega公司.1kbDNAladder，MakerIII，pfuPCRMastermix购自北京天为时代生物公司.pcDNA3.1为我研究所保存.其他试剂均为化学分析纯.1.2方法根据已知人的TFF2基因的蛋白序列（GeneBank登录号：NP_005414）来设计合成TFF2表达cDNA序列.我们还在TFF2的信号肽和成熟TFF2

3、之前，插入一段cmyc的标记(tag)，形成cmycTFF2.为便于进一步的亚克隆，在cmycTFF2的氨基端添加BamHI酶切位点，在羧基端（即终止密码子之后）添加EcoRI和XbaI酶切位点.cmycTFF2最终设计序列约450bp.然后，按每40bp的核苷酸的长度设计22条引物，参考有关文献［1］进行.产物经电泳后，切取所需条带用PCR凝胶回收试验盒进一步纯化.再用上下游两末端引物扩增35个循环后，加入25mmol/L浓度的dATP1μL，72℃保温15min.取上述PCR终产物约3μL，用pGMTeasy试剂盒进行TA克隆.方法按Pr

4、omega公司提供的说明书进行.克隆产物经EcoRI酶切鉴定后送博亚生物公司进行测序.应用质粒小量提取试剂盒，提取测序正确的阳性克隆重组质粒经EcoRI和BamHI双酶切及琼脂糖凝胶电泳后，以柱式小量切胶回收试剂盒回收400bp左右大小的电泳条带，质粒pcDNA3.1用相同的酶酶切后用乙醇沉淀法回收大片段，将回收的大小片段按1∶8的分子比用T4连接酶连接，用低温氯化钙法转化宿主E.coliDH5α感受态细胞涂布于含氨苄青霉素（100mg/L）的LB培养基上用EcoRI和BamHI酶切鉴定［2］，阳性克隆送博亚生物公司测序.2结果将按TFF2基

5、因设计的40bp的寡核苷酸混合，用pfuMastermix进行拼装，结果发现，在第1次扩增时，电泳带呈拖尾状（smearing），并没有发现有明确的条带出现，但拼装的产物经稀释，再加入两端的引物进行第3次扩增时，可以见到所需的420bp的条带（图1）.在它的前后面有较弱的梯形带.为进一步得到更纯的产物进行克隆，我们将产物纯化，再用未端引物进行PCR扩增，可见到一条非常清晰的目的基因带.为进一步克隆，我们将PCR产物在Taq酶存在的条件下，进行未端加T.然后，连接于pGMTeasy载体.将连接产物转化至大肠杆菌中，经蓝白斑筛3讨论三叶肽是一类较

6、新的胃黏膜保护因子，成熟的TFF2是一个由106个氨基酸组成的蛋白质，我们利用PCR技术，在体外成功地拼装了TFF2基因.这一技术是在以往同类研究的基础上进行改良的.但与原方法相比，操作更为简单、方便和快捷.我们采用的PCR拼装系统为pfuMastermix.这省去了优化PCR系统的时间，并且由于pfu酶复制的真实性，可以真实地保持产物与设计的一致性.在实验中，我们还采用了TA克隆的技术对产物进行克隆，而不是如原方法那样，首先在产物中设计好酶切位点，大量扩增产物后将产物纯化，然后进行酶切，再纯化后克隆，而是对产物直接进行克隆.这大大减化了操作

7、步骤并提高了效率.另外，以前的方法中采用了pfu和Taq酶的复合物作为拼装体系，由于Taq酶缺乏纠错能力，有使产物出现突变的可能.而我们在进行产物拼装和扩增时完全用pfu酶，因而，更高地保证了产物拼装的真实性.我们将拼装的TFF2基因连接于pGMTeasy载体，拼装的TFF2序列与设计序列完全一致.又进行双酶切将TFF2切下来连接至pcDNA3.1上，经转化克隆，得到所需要的带有TFF2的真核表达载体.经酶切鉴定及测序与设计TFF2序列完全一致.【