青鲨软骨血管生成抑制因子的制备【开题报告】

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1、毕业设计开题报告药学青鲨软骨血管生成抑制因子的制备一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义我国蕴藏着丰富的海洋生物资源。现已证实，不少海洋生物活性物质具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗艾滋病、抗心脑血管疾病、抗老年痴呆症以及抗疲劳、增强免疫、延缓衰老等功效。由此引起世界各国对开发海洋生物的极大兴趣，它已成为现代医药保健品开发研究的热点[1]。近年来，肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是仅次于心脑血管疾病危害人类健康的第二大杀手。据统计，全世界每年约有700万人死于癌症，约占总死亡人数的四分之一[

2、2]。目前，已有许多抗肿瘤药物应用于临床，但多因其副作用大而在应用上受到限制。因此，人们逐渐将注意力转向从动植物中提取副作用小的抗肿瘤有效成分。近20年来发现鲨鱼的整个内骨骼几乎全由软骨组成，并且鲨鱼不长肿瘤，推论鲨鱼体内存在某种抑制肿瘤生长的物质[3]。1对肿瘤细胞的杀伤作用在鲨鱼软骨中存在抗肿瘤因子，可直接杀伤肿瘤细胞，抑制细胞骨架的形成或使细胞骨架发生凝聚和固缩，破坏其结构完整性[4]。2对新生血管生长的抑制作用鲨鱼软骨蛋白可以抑制鸡胚胎血管化和基质胶诱导的血管生成，抑制乳腺癌和人恶性胶质瘤的

3、生长，阻止乳腺癌和Lewis肺癌的转移。软骨的这种作用可能与其抑制金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的作用有关[5]。3抗氧化作用　鲨鱼软骨中提取的一种水溶性组分具有抗炎和止痛作用。这种组分能清除活性氧自由基，保护细胞不发生突变，间接起到抗肿瘤作用[6]。4增强机体免疫力　鲨鱼软骨活性物质抗肿瘤的另一原因是其可以激活机体的免疫系统，活化NK细胞及巨噬细胞以增强攻击癌细胞的能力。活性物质通过抑制致敏红细胞，刺激CD4+和CD8+渗入肿瘤细胞增强迟发型超敏反应，从而增强免疫应答[7]5。鲨鱼软骨多糖对胸腺和脾脏具

4、有刺激作用，同时能活化巨噬细胞，使其表面伸出较粗大的伪足，提高机体的免疫力，刺激白细胞分泌TNF[8]。国内外愈来愈多的研究证实，鲨鱼软骨含有能阻止病理性血管生长的特殊物质，从而断绝肿瘤的血液供应，使肿瘤减缓生长，萎缩甚至消失,抗癌作用显著。而且对类风湿性关节炎等顽疾也有效[9]。我国医药界有识之士已经开始注重在全国范围内推广鳌鱼软骨的应用研究，造福众多的癌症患者及多种顽疾患者。以肿瘤血管为治癌新靶这一全新治癌理论的创立和抑制肿瘤新生血管的有效物质——鲨鱼软骨的最新发现为整个医学界乃至全人类带来了最

5、终攻克癌症的希望和曙光。青鲨属脊椎动物门、软骨鱼纲、真鲨目、真鲨科、大青鲨属，俗称蓝鲨、大青鲨。青鲨是一种世界上最普遍也是分布最广的鲨鱼，几乎遍及热带和温带海域。1983年美国麻省理工学院LeeA博士和LangerR博士用鲨鱼软骨进行抑制肿瘤实验，在Science杂志上发表文章，称在鲨鱼软骨中含有一种肿瘤血管抑制因子，证明鲨鱼软骨具有一定的肿瘤抑制作用。抑制血管生成，切断肿瘤的营养供应及转移途径，抑制肿瘤的生长和转移，是一条很有希望的肿瘤治疗新途径[10]。本课题从青鲨软骨中分离纯化出具有较强抗氧化

6、活性的蛋白，并对其抑制新生血管的能力进行了比较分析。因此，本课题的研究，将为海洋资源丰富的软骨资源高值化利用开辟一条新的途径，为后续开发高效低毒保健的海洋抗肿瘤新药奠定基础。二、研究的基本内容，拟解决的主要问题：1、研究的基本内容：采用硫酸铵沉淀法进行青鲨软骨总蛋白的制备，再经离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析分离纯化，随后进行抗氧化活性测定试验，包括清除羟自由基，还原力的测定等指标，用电泳法测定青鲨软骨血管抑制因子的分子量，再进行青鲨粗品（60%BSF）、青鲨离子交换(BSFL)、

7、青鲨凝胶过滤（BSFN）抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成的测定。2、拟解决的主要问题：用硫酸铵沉淀法制备青鲨软骨的粗提物，纯化精制，抗氧化活性的测定以及用电泳法测定青鲨软骨血管抑制因子的分子量。比较青鲨粗品（60%BSF）、青鲨离子交换(BSFL)、青鲨凝胶过滤（BSFN）抑制CAM膜新生血管生成效果哪个更明显。三、研究步骤、方法及措施：确定研究对象（舟山海域常见食用鱼类生物青鲨）51、青鲨软骨组织破碎后于PBS浸提，低温离心，(NH4)2SO4分级沉淀得粗蛋白。2、通过离子交换层析（IEC）和

8、凝胶层析（GFC）进行分离纯化获得活性蛋白组分及单体。3、抗氧化活性的测定（1）清除DPPH自由基的能力DPPH自由基清除能力测定按照Bersuder（1998）等[11]描述的方法进行。取一份1mL样品与1mL的99.5%乙醇混合，加入浓度为0.02%的DPPH99.5%乙醇液250μL于同一具塞试管中摇匀。将混合物在暗室室温下放置60min，于517nm处测定吸光度。结果见表3。(以上述所配置的溶液按照下述的方法每个实验平行进行三次，取其平均值，计算相对标准偏差R