牛支原体的分离鉴定及其gapdh基因片段的克隆表达

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1、西南大学硕士学位论文牛支原体的分离鉴定及其GAPDH基因片段的克隆表达姓名：周伟申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：彭远义20120601中文摘要牛支原体的分离鉴定及其G么尸!DH基因片段，的克隆表达预防兽医学专业硕士研究生周伟指导教师彭远义教授牛支原体(必”唧厶船朋口6D协)是一种无细胞壁的原核生物，常存在于牛的呼吸道和生殖道，当牛只长途运输，或免疫力低下时容易被感染，引起严重肺炎、乳腺炎，还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产或不孕等多种疾病。牛支原体病在世界范围内存在，严重损害了养牛业的经

2、济利益：欧洲每年因牛支原体引起的犊牛肺炎经济损失为1．44一1．92亿欧元；近年在我国湖北、贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等省、自治区的牛群中也流行该病。目前国内外缺乏安全有效的牛支原体疫苗，是造成该病多处流行的原因之一。为了确诊重庆某肉牛场爆发的呼吸系统疾病，本研究通过病原分离培养、16S蝴序列测定和牛支原体特异性基因扩增，确定分离株为牛支原体。为了筛选一个适用于牛支原体疫苗生产的抗原蛋白，采用生物信息学软件分析了牛支原体G爿脚基因的免疫学信息，筛选了抗原指数较高的片段进行克隆表达。通过动物试验、westenl-

3、b10t试验和间接ELISA试验分析了重组蛋白的生物学活性，为牛支原体基因工程疫苗的研制提供了参考依据。本试验内容包括以下几个方面：1牛支原体分离株的PCR鉴定扑杀具有肺炎临床症状的病牛，无菌采集肺脏组织，采用实验室病原分离技术进行病原分离纯化。在5％C02培养箱37℃条件下培养的马丁氏培养基中，分离到一小菌落，40倍显微镜下观察菌落呈“煎蛋样’’，命名为CQl。设计合成支原体16SrRNA通用引物和牛支原体卿D伊基因特异性引物，利用PCR方法鉴定分离株。结果表明，该分离株16Srl喇A序列与牛支原体PG45株(登

4、录号：AF332756)相似性为99．9％，与无乳支原体(登录号：AY526879)相似性为99．3％。利用牛支原体昭以)历基因特异性引物，扩增出了1900bp的目的片段，经测序比对，与牛支原体眙雎}／F基因序列重复率为loo％。通过药物敏感性试验和动物试验，初步探索了分离株的药物敏感性和毒力。该分离株对环丙沙星、氧氟沙星、四环素、壮观霉西南大学硕士学位论文素敏感性较高。经胸腔和滴鼻攻毒BABL，c小鼠、昆明小鼠、新西兰大白兔、Z：zCLA长爪沙鼠，不致死试验动物。2牛支原体G爿尸DH基因片段的克隆表达以牛支原体P

5、G45株的G!，董尸D．Ⅳ基因序列为模板，分析其免疫学信息，筛选抗原指数较高的28啦92lbp序列为目的片段进行克隆表达。利用SDS．队GE检测重组蛋白表达形式和表达量。重组质粒pET-32种)／Gz尸脚在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中以可溶性蛋白形式高效表达。3重组蛋白的免疫活性分析将分离株全菌蛋白制成油乳剂疫苗免疫家兔，通过琼脂扩散试验检测多克隆抗体制备效果。多克隆抗体与全菌蛋白形成沉淀线的最高稀释比为1：32，多克隆抗体能与纯化后的重组蛋白形成单一沉淀线。利用WeStem-b10t试验验证了重组蛋白与多克

6、隆抗体能特异性结合，具有较强的反应原性。将重组蛋白作为包被抗原尝试构建间接ELISA鉴别诊断方法，结果表明该方法不能准确区分阴阳性血清，特异性不高。综上所述，本次研究分离到了一株牛支原体，为后续试验提供了实验材料；该分离株G么，DH基因的280~92lbp序列片段在大肠杆菌表达系统中能以可溶性蛋白形式成功表达，便于重组蛋白的分离纯化；多克隆抗体琼脂扩散试验、westem-b10t试验和间接ELISA试验结果表明，重组蛋白有较好的免疫原性和反应原性，为进一步研制基因工程疫苗提供实验依据，但不适用于诊断方法的构建。关键

7、词：牛支原体；分离鉴定；GAJPDH；克隆表达HABSTRCT。IsolationandIdenti6cationofMycoplasmabovisandExpressionofG么尸!D日bOVlSandEXpreSSlOnOto诅尸Z夕以GeneFragmentDiscipline：PreVentiVeVeterina巧Candidate：ZhouWreiDirectedby：ProfPengYrua】nyi丝如印勉嗍口6D’妇isaproka∥otel∞kof∞llwall，whichp佗sentiIltll

8、e他Spiratory龃dreproductiVe劬魄0fba忻鹏，islikelyt0beiIlfle咖edwinl10ng-dis咖cc位msport0rimmuIlocompromisedofca仳le，inducc∞vercpne啪oIlia，mastitis，c锄al∞leadto鼬ritis，comealcorljunctivi!tis，e甜in