Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表达.doc

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1、Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表达【关键词】肾炎　　【摘要】目的大鼠Heymann肾炎（HN）是人类膜性肾病的经典动物模型，其发病机制的研究推动了人们对膜性肾病的理解。Megalin是HN主要致病抗原，也是低密度脂蛋白受体家族成员，其胞外结构形成的4簇配体结合区域均可能存在抗原决定簇。本实验拟克隆其第2簇配体结合区域，并表达融合蛋白，为进一步研究其抗原决定簇的确切位置及其功能打下基础。方法采用RT-PCR获得大鼠肾目的片段Megalin基因3189-4169，再与原核表达质粒pTrcHisA结合构建重组质

2、粒，然后将重组质粒转入TOP10细菌诱导表达融合蛋白，最后用Western-Blot检测表达的融合蛋白。结果（1）RT-PCR获得的目的片段大小为1kb，测序证实为Megalin基因3189-4169;测序报告还显示有3个突变，分别位于Megalin基因的3404、3647、3702，其中前两个突变都不影响融合蛋白的氨基酸序列，第3个突变则将赖氨酸变成谷氨酸，经分析对融合蛋白表达无明显影响。（2）构建的重组质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到预期的2个片段4.4kb和1kb，分别表示质粒pTrcHisA和Megalin基因

3、3189-4169。（3）用IPTG诱导TOP10（含有重组质粒）融合蛋白表达后，经Western-Blot检测发现了38kD的目的蛋白。阳性对照TOP/CAT在IPTG诱导前没有出现蛋白条带，在IPTG诱导后4h出现蛋白条带；阴性对照TOP10（不含有质粒）和TOP10（含有pTrcHisA）经IPTG诱导后均无目的条带出现。另外，融合蛋白的表达量在IPTG诱导后4~6h增加明显。结论成功构建了重组表达质粒（带有Megalin基因3189-4169的pTrcHisA）；成功诱导了融合蛋白的表达，为进一步研究Megalin基因抗

4、原决定簇的确切位置及研究Megalin的功能提供了基础。　　【关键词】肾炎;基因;表位;融合蛋白　　【Abstract】ObjectiveRatHeymannnephritis（HN）isaclassicmodelofhumanmembranousnephropathy.Researchofitspathogenesishelpunderstandthehumanmembranousnephropathy.MegalinisthemajorantigenofHN,anditisalsoamemberofthelowdensity

5、lipoproteinreceptorgenefamily；itsextracellularregioncanbindmultipleligands,andthisextracellularregionformfourclustersofligand-bindingdomainscontainingpathogenicepitopes.SoweclonedthesecondclusterofligandbindingrepeatsandexpresstherecombinantproteinscontainingN-Termin

6、al6xHistags.Thisstudywasaimedtoprovidethebasistopreciselylocatethepathogenicepitopeandhelpunderstanditsfunction.MethodsWeappliedreversetranscriptionPCRtoobtainobjectiveband（Megalingene3189-4169）,thenconstructedtherecombinantplasmidbyinsertingthisfragmentintopTrcHisA.

7、AftertherecombinantplasmidwastransfectedintoTOP10,theexpressionof96xHisfusionproteinwasinducedbyisopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）.FinallyWestern-Blotwasperformedtodetectthefusionprotein.ResultsRT-PCRshowedthesizeofobjectbandwss1kb.Afterrecombinantplasmidweredigeste

8、dwithBamHⅠandEcoRⅠ,weobtainedtwofragments:onesizewas1kb,theotherwas4.4kb.Western-Blotshowedthefusionproteinsizewas38kD，andtheyieldo