鸡cvh基因截取片段的克隆、原核表达及其多克隆抗体制备

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4、取得的研究成果，论文不包含任。除已特别加Ｗ标注和致谢的地方外何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检

5、索和传播，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：在年解密后适用授权。保密。＂＂请在上相应方框内打Ｖ（）论文作者签名；日期：諫Ｃ＇（ｊ指导教师签名；矣日期：Ｗ作者联系电话：电子邮箱：广巧大＃项去单化化文巧Ａ因化取々？战巧克隆ＣＶＨ、化巧表达及其多义巧化化巧伽备巧ＣＶＨ基因ｆｔ取片段的克Ｋ、原孩表远及其多克Ｋ抗体制备巧要ＣＶＨ（Ｃｈｉ浊ｅｎＶＡＳＡＨｏｍｏｌｏｇ）基因是ＶＡＳＡ基因的同源基因，其表达的Ｃｖｈ蛋白含有ＤＥＡＤ－ｂ

6、ｏｘ保守基ＲＮＡ解序，具有旋酶活性，在生殖系细胞中特异性存在，对配子的形成起着决定性的作用。因此，ＣＶＨ基因作为生殖系细胞的标志基因，在巧胎干细胞（ＥＳ）和原始生殖细胞（ＰＧＣ）的研究中用于鉴别和筛选生殖系细胞。－本研究旨在通过克隆鸡ＣＶＨ基因的片段，利用原核表达系统获得曲ｓＣｖｈ融合蛋白，纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔制备抗ＣＶＨ基因的多克隆抗体。利用Ｔｒｉｚｏｌ法提取３周龄的鸡睾丸中的总ＲＮＡＲＴ－ＰＣＲＣＶＨ基因６４０ｂ，用扩増中ｐ的编码序列，并－ＳＴ载体上构建－Ｔ－ＣＶＨ重组质粒将其克隆

7、到ｐＭＤｌＰＭＤ１８。经鉴定序列正确的阳性质－－－，将其插入的目的基因亚克隆至ＥＴ３０ａ表达载体上粒ｐ，构建ｐＥＴ３０ａＣＶＨ重组质粒，－ＤＥ３－经双酶切鉴定正确的质粒转化ＥｃｏｆｔＢＬ２１，用１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基硫代Ｄ（）Ｐ半乳糖‘０１－甘（巧了）３７。直温下诱导４１１．，使其表达目的蛋白？乂０５与＼￥６８１６〇１６１〇＊检，用８０３测和鉴定目的蛋白的表达。确定目的蛋白表达后８ｍｏｌ／－，用Ｌ尿素溶解蛋白，通过ＮｉＮＴＡ－Ｃｖｈ亲和层析柱对出ｓ融合蛋白进行纯化。得到的纯化蛋白与弗氏佐剂混合乳

8、化后，分三次皮下多点注射免疫新西兰大白兔、，每次间隔３周。于第Ｈ次注射后第７天，也脏采血后收集血清，该血清即为制备的抗ＣＶＨ基因多克隆抗体。最后通过分离的第５．５天的鸡胚生殖崎作为抗原，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｃｖｈ多克隆抗体的特异性。结果表明；（１）本实验克隆了鸡ＣＶＨ基因ＯＲＦ框中的６４０ｂｐ编码片段