鸡源志贺菌的分离鉴定、ipac基因的克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

《鸡源志贺菌的分离鉴定、ipac基因的克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河南农业大学硕士学位论文鸡源志贺菌的分离鉴定、IpaC基因的克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备姓名：苗银萍申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：许兰菊201206河南农业大学2012届硕士研究生论文中文摘要志贺菌是人类感染性腹泻的主要病原体之一，也可感染人以外的灵长类动物。以往人们认为志贺菌不感染畜禽，事实上，国内外大量的资料表明志贺菌可感染猪、牛、兔、鸭、鸡等畜禽，并可引起它们发病甚至死亡。鸡志贺菌病是近些年发现的急性传染病。该病流行广泛，危害严重，可引起不同品种、不同日龄的鸡发生腹泻，并可导致雏鸡死亡，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。又因志贺菌可能在

2、人禽间造成交互感染，这就给人类公共卫生安全造成了严重隐患。因此，对鸡志贺菌病展开研究不但具有重要的兽医卫生学意义，而且具有重大的医学公共卫生学意义。本研究以采集的腹泻鸡病料为材料进行志贺菌的分离，之后克隆、分析鸡源志贺菌IpaC基因，最后原核表达IpaC蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。具体研究结果如下：1．通过分离培养、抹片镜检、生化试验、PCR试验及动物试验对腹泻鸡病料进行志贺菌的分离鉴定。结果显示：从驻马店腹泻鸡心血中分离出1株志贺菌；该茵致病性较强，攻毒组雏鸡发病率为100％(10／10)、病死率为50％(5／10)，临床表现为病鸡拉血便，重者脓血痢；病(死

3、)鸡剖检可见肠壁变薄、有出血斑，肝脏肿大出血，肺出血、淤血，脾脏出血，肾肿大；镜检可见肠道、肝脏、脾脏、肺脏有明显病变，具体表现为肠粘膜上皮细胞坏死脱落，肠绒毛结构崩解，固有层出血，肠腺萎缩，肝脏中央静脉及窦状隙扩张淤血，脾窦淤血，肺泡、支气管、呼吸性支气管淤血。2．根据GenBank上发表的人源志贺菌IpaC基因ORF两端的保守区设计一对引物，用PCR方法从ZMD-01株鸡源志贺菌毒力质粒上扩增出IpaC基因片段并成功克隆到pMDI8．T载体后进行测序。测序结果表明：与人源志贺菌相比，发现仅存在2个碱基突变，757位T变为C，936位G变为A，757位的突变使

4、精氨酸变为甘氨酸，对蛋白的表达没有太大的影响；。志贺菌不同分离株的IpaC基因的同源性很高，核苷酸序列同源性在97．30／0-99．9％之间，其推导的氨基酸序列的同源性在96．2％．99．7％Z问，其中，鸡源志贺菌IpaC基因与日本株福氏志贺菌X15319的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性最高，同源性分别为99．8％、99．7％，与美国株鲍氏志贺菌CP001062的核苷酸序列的同源性最低，为97．3％，与美国株鲍氏志贺菌CP001062和澳大利亚株痢疾志贺菌AY206439IpaC基因推导的氨基酸序列的同源性最低，为96．4％；分离株ZMD-01株鸡源志贺菌

5、与参考株AL391753相似性较大，它们在同一个分支上。3．将ZMD-01株志贺菌IpaC基因克隆至载体pET32a(+)中，构建了原核表达载体pET32a(+)-IpaC。然后将重组表达质粒转化至宿主菌BL21(DE3)qb，以IPTG作为诱导剂进行诱导表达，SDS—PAGE试验结果表明成功表达IpaC重组蛋白。该重组蛋白分子量约为63kDa，经薄层凝胶光密度扫描分析，目的蛋白占菌体总蛋白的21％。对诱导前菌液培养时间、IPTG浓度、诱导时间这三个条件进行优化，最终确定最佳培养条件：将含重组表达质粒河南农业大学2012届硕士研究生论文pET32a-IpaC的B

6、L21(DE3)菌液培养3h(OD值约为O．6)加入终浓度为1．0mM的IPTG，诱导4h时目的蛋白的量最大。大量表达目的蛋白后裂解细菌，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE，结果显示目的蛋白既存在于上清中，也存在包涵体中。上清液直接经Ni-AgaroseHis标签纯化试剂盒纯化后纯度可达90％以上。WesternBlot分析显示，重组蛋白与ZMD-01株阳性血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白免疫公鸡，血清最高效价可达1：12800，说明该蛋白具有良好的免疫原性。关键词：鸡源志贺菌；分离鉴定；IpaC基因；克隆测序；原核表达；多克隆抗体制备2河南农业大学201

7、2届硕士研究生论文IsolationandIdentificationofShigellafromChickenandClone、ProkaryoticExpressionandPolyclonalAntibodyPreparationofIpaCgene．．．Supervisor：Prof．XuLanjuMasterCandidate：MiaoYinp吨‘．Shigellaeareoneofthemostimportantpathogenswhichcauseinfectiousdiarrheainhuman．Theycanalsoinfectprimates

8、(excepthuman