鸡MHCⅡαβ链基因的克隆和原核表达及其抗体制备

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中文捅蔓主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是由紧密连锁的高度多态的基因位点所组成的位于染色体上一个遗传区域，广泛存在于所有脊椎动物，具有高度的多态性和保守性。该基因区编码的蛋白通常称为MHC分子或MHC抗原，是移植物排斥的主要决定簇。根据结构和功能可将MHC分为I、II、III三类。其中，MHCII类分子是由2条非共价结合的多肽链(o【链和B链)构成的糖蛋白，它们由不同的MHC基因编码。c【链(32000～34000)比B链(29000～32000)略大，2条链均含有寡糖，旺链糖基化程度较高。结构上I类分子和II类分子均可分成肽结合区、Ig样区、跨膜区和胞浆区4个部位。MHCII类分子选择性地分布于有免疫功能的细胞如B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、激活的T细胞等细胞膜上。MHC的主要功能是递呈抗原肽段，通过MHC．抗原肽复合物活化、诱导T细胞和B细胞的免疫应答。MHCII类分子递呈的抗原主要是外源性抗原。为了探索鸡MHcII类分子在免疫应答中的作用及其机理，本研究运用分子生物学技术，进行了克隆、表达和鉴定。首先，根据GenBank中登录的鸡类MHCII的o【链和D链基因序列与载体DGEx-4T-1的多克隆酶切位点分别设计两对引物，利用反转录一聚合酶链式反应(RT．PCR)从有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激18h活化的鸡脾淋巴细胞中扩增出相应大小的a链(77lbp)和D链(798bp)的基因；经酶切鉴定，所扩增的a链和§链基因片段含有相应的酶切位点：然后将这两个片段分别插入载体pGEX．4T．1中，并转化宿主菌BL21，经双酶切鉴定重组质粒pGEX一4T一1／a和pGEX-4T-1／13后，对Ⅱ链和D链的核苷酸序列进行测定。结果表明本研究成功地克隆了鸡MHCII的a链和B链基因，它们分别编码771和798个核苷酸。与GeneBank登录的仪链基因(登录号：AY357254)相比较，只有四个核苷酸的差异，同源性为99％，导致2个氨基酸的改变。同样，与GeneBank登录的B链基因(登录号：$66480)相比较，有42个核苷酸的差异，同源性为95％，导致27个氨基酸的改变。其次，将上述构建成功的原核表达重组质粒pGEX．4T一1／IXSfnpGEX．4T一1／B，转化大肠杆菌BL21，经异丙基一B-D一硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导培养4h，表达出含有谷胱甘肽一S一转移酶(GST)的融合蛋白GST—d和GST—p；对表达条件进行相应的优化，确定了最佳诱导表达时间和诱导剂浓度；对表达蛋白的可溶性进行鉴定，结果表明表达的融合蛋白GST．程和GST．p均以包涵体形式存在；利用优化的原核表达条件对含有质粒GST．0【和GST．D的BL21菌进行大量诱导表达，通过反复冻融和超声裂解诱导菌，获得浓度较高的GST—d和GST-p包涵体蛋白，用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解，溶解的包涵体通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析获得 纯化的GST．a和GST—D融合蛋白。最后，利用上述纯化的GST—d和GST．B融合蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备鼠抗鸡0【链和B链多克隆抗体。琼脂扩散实验和ELISA实验表明制备的两种多抗均具有良好的抗原性。综上所述，本研究成功地克隆了鸡的II类MHC的cc链和D链基因，构建了原核表达质粒，并进行了原核蛋白表达和纯化，并制备了效价高、反应性和特异性强的鼠源抗鸡II类MHC的a链和D链多克隆抗体，为进一步研究鸡的II类MHC基因的免疫功能和生物学活性奠定了基础。关键词：鸡MHCIIa邝链克隆原核表达多抗制备 AbstractThenlajorhistocompatibilitycomplex(MHC)isanextendedclusterofgeneswithextraordinarypOlymorphismandcompactlinkageinthechromosome，spreadingoverallvertebrates．MHCmoleculesarealsoconsideredastheprimarydeterminantsinthetransplantrejection．Accordingtotheirstructureandfunction，MHCmolecuIescouldbedividedintoclassI，IIandIII．ClassIImoleculesareglycoproteinsthatareformedbytwononcovalence—associatedchains，0【(32000～34000)andB(29000～32000)，eachofwhichisencodedbydifferentMHCgenes。Likeclasstmolecules，classIImoleculesconsistofpeptide—bindingregion，imnmnoglobulin—likeregion，transmenbraneregionandcytoplasmicregion．ClassIImoleculesmainlydistributeonthemembraneofthematuringBcells，presentingcells(macrophagecellsanddendriticcells)andactivatedTcells．ThesemoleculeshaveaneffectonpresentingantigenandactivatingTcellsbyformingclassIImolecule-antigenpeptidecomplex，whichcallstimulateTcellsandBcellstOparticipateinimmuneresponse．HoweverclassIImoleculesmostlypresentexogenousantigen．InordertoresearchthefunctionandmechanismofclassMHCIIofchickeninimmuneresponse，wecloned，expressedandidentifiedthegeneofchain0【and13ofclassII．Firstly,accordingtomRNAgenesequenceregisteredinGenBankandmulti—cloningrestrictionenzymesitesofvectorpGEX-4T-1，twopairsofspecificprimersforthegenesofchain毡andBofclassIIofchickenweredesignedandsynthesizedrespectively．UsingtotalRNAfromConA-stimulatedchickenspleenlymphocytes，twogenesabout771bpand798bpwereamplifiedbyRT—PCRrespectively．TheresultsofendonucleaseEcoRIdigestingRT·PCRproductofchainccandendonucleasePst[digestingRT-PCRproductofchainDshowthattwogeneshavethecorrespondingrestrictionenzymesiteastheknownaandBgene．ThenthegeneswereinsertedintovectorpGEX一4T一1respectively,andtherecombinantplasmidsweretransformedintoEcoliBL21．TherecombinantplasmidpGEX一4T—l／awasidentifiedbyBamHI+SalldigestionandtherecombinantplasmidpGEX-4T-1／lBwasidentifiedbyEcoRI+SalIdigestion．Then，thepositiverecombinantclonewassequencedandanalyzed．TheresultsshowthatthecompleteORFof0【genecontains771nucleicacidsandencodes256aminoacids；thenucleotidesequencesimilarityisapproximately99％withthereported仪gene．Meanwhile，thecompleteORFofBgenecontains798nucleicacidsandencodes266aminoacids；thenucleotidesequencesimilarityisapproximately95％withthereportedchickenBgene，Thesesuggestthatthe理IIl andBgenesofchickenMHCclassIImoleculeshavebeensuccessfullyclonedfromchickenspleenlymphocytes．Secondly,theconstructedrecombinantplasmidspGEX-4T·1／apGEX一4T—l／BweretransformedintoE．coliBL21theninducedtoexpressGST—CtGST．BfusionproteinbyIPTGatdifferentconcentrationatdifferenttimes．Afteroptimizingprokaryoticexpressionconditions，4hwasdeterminedastheoptimuminductiontime1mmol／LwasdeterminedastheconcentrationofIPTG．GST—aGST—BfusionproteinsolubilitieswereidentificatedtheresultindicatedthatexpressedGST．aGST．Bproteinwerelocatedininclusionbodies．Undertheoptimalcondition，therecombinantplasmidswereinducedtoexpresslarge—scaleGST-0lGST—Bfusionproteinstheinducedrecombinantbacteriawerelysedbyfreeze-thawsonication．TheobtainedGST-C／,andGST—Binclusionbodyproteinsweresolubilizedbysonicationwiththeaddingofthedetergentlauroylsarcosine．ThesolubilizedGST—o【andGST—Bproteinwerepurifiedbyaffinitychromatography、析thglutathioneagarose．Finally,micewereimmunizatedwiththepurifiedGST-aGST-BfusionproteinsthepolyclonalantiserumagainstchainⅡand8ofchickenwerecollected．AspecificreactionappearedbetweentheantibodiesGST一0【andGST-8fusionproteininagardiffusionassayinELISA，theseresultsindicatedthatfusionproteins，GST—aGST-p，hadstrongantigenity．Inconclusion，inthisstudythegenesofchain。【andBofchickenclassIIMHCwereclonedsuccessfully,therecombinantplasmidsofpGEX-4T-1／MHCIIapGEX*4T‘1／MHCIIpwereconstructedtheGST-c,／pfusionproteinswereexpressedinprokaryoticcellspurified，andthespecificpolyclonalantiserumagainstchain0【andpwereprepared．AllthesewouldprovidesomeexperimentalmaterialsforthefurtherstudiesontheimmunityfunctionofapofchickenclassIIMHC．Keywords：chickenMHCII“D，cloning，prokaryoticexpression，preparationofpolyclonalantibodyIV 插图和附表清单图4．1鸡脾细胞抽提的RNA电泳结果⋯⋯一图4—2aRT—PCR扩增产物及其酶切鉴定结果图4—38RT．PCR扩增产物及其酶切鉴定结果图4-4pGEX．4T．1／Ⅸ的双酶切鉴定结果⋯⋯-图4．5pGEX．4T．1／9的双酶切鉴定结果⋯⋯··图4-6不同来源鸡d链基因核甘酸序列比较·。图4．7不同来源鸡a分子氨基酸序列比较⋯-图4-8不同来源鸡D链基因核甘酸序列比较·-图4-9不同来源鸡D分子氨基酸序列比较⋯·图4—10Ot表达产物的SDS．PAGE图谱⋯⋯⋯·图4．1lB表达产物的SDS—PAGE图谱⋯⋯⋯·图4—12GST—a融合蛋白的可溶性鉴定⋯⋯⋯”图4-13GST．B融合蛋白的可溶性鉴定⋯⋯⋯·图4—14不同IPTG浓度pGEX．4T．1．Ⅸ的表达⋯图4—15不同IPTG浓度pGEX一4T．1．B的表达⋯图4—16不同诱导时间pGEX．4T一1一吼的表达⋯·图4．17不同诱导时间pGEX．4T．1一B的表达⋯·图4一18GST／d包涵体的SDS．PAGE电泳分析一图4—19GST／13包涵体的SDS．PAGE电泳分析--图4．20纯化的融合蛋白GST．a的SDS—PAGE··图4．21纯化的融合蛋白GST—B的SDS．PAGE一图4．22标准蛋白(BSA)曲线及其方程式⋯‘表4-1鼠抗鸡a抗体的ELISA检测结果⋯⋯⋯·表4—2鼠抗鸡D抗体的ELISA检测结果⋯⋯⋯附录A鸡0【基因测序彩图(BGH)⋯⋯⋯⋯⋯⋯·’附录B鸡6基因测序彩图(BGH)⋯⋯⋯⋯⋯⋯∞”如”儿弛"弱¨巧”弘弘""弘弘如"知∞甜札叭酡以 本论文常用中英文缩写词AmpAmpicilinAPCAntigen-presentingcellbDBasepairBSABovineserumalbumincDNAComplementaryDNADeoxyribonucleotideacidDEPCDiethylpyrocarbonateDTTDithiothreitolE．BEthidiumbromidKDKilo．daltonEDTAEthylenediaminetetraaceticacidEREndoplasmicreticulumgGramGSTGlutathioneS．transferasehHourIiInvariantchainIPTGIsopropylthio—B—D—galacatosideLBLuria．BertanimgMilligramMHCMajorhistocompatibil蚵complexminMinutemLMilliliterODOpticaldensity0RFOpenreadingframePAGEPolyacrylamidegetelectrophoresisPBSPhosphaticbu圩ersolutionPMSFPhenylmethlosultonylfluorideRNARibonucleotideacidRNasinRibosomenucleotaseinhibitorrl：ImRevolutionperminuteRT．．PCRReversetranscriptase—PolymerasechainreactionSSecondSDSSodiumdodecylsulfateTris11ri-(hydroxymethyl)-aminomethaneuLMicroliterVIII氨苄青霉素抗原呈递细胞碱基对牛血清白蛋白与RNA互补的DNA脱氧核糖核酸焦碳酸二乙酸二硫苏糖醇溴化乙锭千道尔顿乙二胺四乙酸内质网克谷胱甘肽．s．转移酶小时恒定链异丙基硫代一13．D半乳糖LB培养基毫克主要组织相容性复合体分钟毫升光密度开放读码框架聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸缓冲液苯甲黄酰氟核糖核酸RNA酶抑制剂每分钟转数反转录，聚合酶链反应秒十二烷基磺酸钠三羟甲基氨基甲烷微升 独创-II：声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：{靠砼时间：川年g月纠旧关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用景-爹Ep、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：i刍丝垒：时间：>研年6月印同导师签名时间：a厂年Z，舡VFI一红 1．文献综述1。1MHC的发现和命名t936年，Gover在研究小鼠血型抗原与移植肿瘤的关系时发现【l】，用不同品系小鼠的红细胞免疫家兔，并用所得的抗血清检查不同品系的小鼠的红细胞，检出4种红细胞抗原，其中第2种抗原(抗原H)具有特异性，抗原H仅存在于某些品系小鼠中。而且抗原H还是正常组织和一株特定的肿瘤细胞所共有。缺乏这种抗原的小鼠，接受从具有这种抗原的供体来源的肿瘤移植物时，移植物会自行消退，并产生抗该肿瘤的同种抗体。说明阻止移植肿瘤生长的是一种免疫现象，而抗原H则是一种组织相容性抗原。于是Gover就将控制抗原的基因称为组织相容性基因或H一2。美国科学家G．D．Snell受Govcr的发现启示，自1935年起将其兴趣由从事小鼠染色体突变的研究逐渐转向小鼠组织器官移植中的遗传学和免疫学问题的研究，他培育出了69个同类系(Congenicstrains)，为弄清编码组织相容性抗原的基因座位打下了坚实基础。随后，Snell与Gover合作，利用同类系小鼠证实了小鼠组织相容性基因位于第17号染色体上，称其为H．2基因复合体，编码H．2抗原。Snell由此推论在所有的脊椎动物内都有H一2复合体的类似结构，它们编码主要组织相容性抗原。正如Snell所预见的那样，在人、鸡、猪、马、牛、羊中均发现了类似H一2复合体结构存在，统称为MHC。在人类MHC又称为人类白细胞抗原(humanleucocyteantigen，LA)基因系统，在猪中也称为猪白细胞抗原(swineleucocyteantigen，sLA)基因系统，牛、马、绵羊、山羊中其白细胞抗原分别命名为BOLA，ELA，OLA，GLA，都是在白细胞抗原缩写符号前加上该物种英文名或学名的第一个或头两个字母，但小鼠、大鼠和鸡的白细胞抗原符号分别为H．2，RTl和B，小鼠和大鼠未用标准命名法是因为在此之前己被人们所广泛接受，而鸡最早是作为B红细胞血型系统被认识的。同种异体进行组织移植时，移植物能否成活取决于供体与受体的细胞表面抗原，如果两者的抗原特异性相同，则移植物易于成活，若两者的抗原特异性不同，则会发生排斥反应。这种引起排斥反应的抗原称为移植抗原(transplantationantigen)，办称组织相容性抗原(histocompatibilityantigen)，其中能引起快而强的排斥应答的抗原系统称为主要组织相容性系统(majorhisocompatibilitysystem，MHS)，编码MHS的基因群为主要组织相容性复合体(majorhisocompatibilitycomplex，MHC)，由于MHC是一群紧密连锁的基因群，它们编码的抗原决定着机体的相容性，且与免疫应答和免疫调节密切相关，在人类免疫学和遗传学中～直是研究的重点。在鸡中也较为重视，已发现鸡的某些MHC单倍型(haptotype)与免疫应答、抗病性及经济性状间具有相关性，但对其研究远远落后于人类。 1．2MHCII的结构和分布MHC编码蛋白通称MHC分子或MHC抗原，是移植物排斥的主要决定簇。按其结构和功能的不同可分为I、II、III类。第1II类属补体(complement)成分，我们主要讨论第Ⅱ类抗原分子。1．2．1MHCII类分子结构MHCII类分子是由2条非共价结合的多肽链构成的糖蛋白。2条链在整个结构上彼此相似。a链(32—34KDa)Ltp链(29—32KDa)略大，两条链均带有寡糖。a链糖基化程度较高。每条链的三分之二位于胞外空间。MHCII类抗原的2条链均由不同的MHC基因编码，呈多态性，个别例外。MHCII类抗原与I类抗原一样也被分成肽结合区、Ig样区、跨膜区和胞浆区4部位。(1)．多肽结合区Ot链和D链的胞外部分可分成两个90个氨基酸残基的片段，分别称为dl、a2、pl和p2。dl和pI相互作用形成肽结合区，这与MHCI类分子形成肽结合槽只涉及Ⅱ链的情况不同。al和Bl折叠形成8股反向平行的13片层及其支撑的2条反向平行的d螺旋，其中4股p片层和1个0【螺旋由al提供，而其它4股B片段和另一个a螺旋由p1提供。II类0【l和I类al一样不含二硫键环，而II类131和I类O．2均有二硫键环，且均有相同部位。和I类结构一样，II类d螺旋和B片层分别构成肽结合槽的侧壁和底部。多肽残基集中在Ⅸ1和pl，位于肽结合槽的o【螺旋侧壁或D片层构成的槽底，其侧链指向槽面或a螺旋顶部，MHCII类分子的基因多态性决定结合槽的化学表面的特性，这是肽结合特异性和亲和性及T细胞识别的主要决定因素。像I类抗原那样，经遗传而获得的结合抗原的高水平的多态性，可防止出现不能与任何II类分子结合的微生物肽。(2)免疫球蛋白样区MHCII类抗原的Ⅱ2和p2区段含有链内二硫键。根据氮基酸顺序，它属于Ig基因超家族。和MHCI类的啦和p2。一样，这些区段实际一I-在天然MHC分子内被折叠成Ig样功能区。对某一特殊II类基因的不同等位基因来说，II类毗、9l和p2段基本上是非多态性的，而在不同基因位点上显示某些差别。II类分子的Ig样区对于两链间的非共价作用至关重要。一般一个位点的仳链只与相同位点的B链配对，通常不与其他的p链配对。(3)跨膜区o【2和D2结构域C端侧各有一个短的连接区，分别连接a2和p2结构域与跨膜区。跨膜区约含25个氨基酸残基，形成Ⅱ螺旋将p链和旺链固定在细胞膜上。(4)胞浆区胞浆区很短，有25．30个氨基酸残基，可能与信号转导有关。1．2．2MHCll分子的分布II类MHC抗原选择性地分布于具有免疫功能的细胞(B细胞【2】、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞刚l、激活的T细胞等)以及精子、血管内皮细胞、皮肤的郎罕细胞等细胞膜上。经常表达II类抗原的有成熟B细胞和抗原递呈细胞(巨噬细胞，树突状 细胞)。上皮细胞、血管内皮细胞、脑胶质细胞等在IFN7存在下表达，在病理状态下，Graves病及桥本病的甲状腺滤泡细胞，青年型糖尿病的胰岛细胞可见有D类抗原的异位性表达，这可能与自身免疫病的进展有关。在B细胞，II类抗原表达因分化阶段不同而呈现差异。前B细胞经IL．4诱导而表达，成熟B细胞则经常表达，浆细胞刁：表达。T细胞活化时，亦伴随有II类抗原的表达。此外，II类抗原中DR、DQ、DP的表达水平也彼此不同，DR分子的表达最多，其次DP分子，再次为DQ分子。所有成熟B细胞均有DR、DP抗原的表达，但仅部分表达DQ抗原。1．3MHCll分子的功能MHC的名称来源于同种异体组织器官移植的排斥，但沿用至今的名称远远不能涵盖主要组织相容性抗原在体内的生物学功能。实际上，MHC的主要功能在于递呈抗原肤段，以MHC，肽段复合物形式活化T细胞，从而激发T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫应答。MHC在递呈抗原时，MHCI和MHCII有所差异，MHCI类分子递呈细胞内源性抗原(endogenousantigen)(来自于胞浆或核蛋白，如细胞自身蛋白，病毒蛋白，细胞内寄生的细菌蛋白等)，MHCII类分子递呈的抗原主要是外源性抗原(exogenousantigen)。在其递呈抗原的过程中有结构Ii[5】、calnexin、Bip、grp94、ERP72等分子参与。MHC／J]太段复合物所激发的正常状态的免疫应答可以帮助机体清除感染和发生突变的肿瘤细胞；而一旦所诱导的免疫应答发生异常，则可造成感染不愈，肿瘤生长失去控制或者产生自身性免疫性疾病。1．3．1MHCII类分子的抗原递呈MHCII类分子抗原递呈途径包括抗原肽段产生、肽段和内质网中组装的MHCII类分子分别进入MHCII类分子器室(MHCclassIIcompartment，MIIC)，以及肽段在MHC中与MHCII类分子结合和表达三个阶段。大多数情况下，MHCII类分子递呈外源性抗原。外源性抗原在MHC中被组织蛋白酶水解成合适大小的肽段，同时内质网中正确折叠组装的MHCII类分子也进入MIIC，在MHC中肽段与MHCII类分子的肽结合沟槽结合。MHCII／抗原肽段复合物再经过分泌途径表达在细胞膜上，被CD4+T细胞TCR识别，诱导产生辅助性T细胞免疫。MIIC的性质目前尚不能完全确定，可能涉及多种亚细胞结构，包括内体(endosome)和溶酶体(1ysosome)，所以MHCII类分子抗原递呈途径也称为外源性抗原递呈途径，内体／溶酶体途径、细胞内吞途径(endocyticpathway)或MIIC途径。1．3．2MHC限制性MHC限制性是TCR识别抗原的基础，是指CD8+T细胞只能识别抗原递呈细胞fantisenpresentingcell，APC)或靶细胞表面与自身相同的MHCI类分子和抗原肽段形成的复合物，CD8+T细胞在识别抗原递呈细胞的同时，必须先识别递呈细胞的I类抗原，才能接受抗原信号，具备杀伤靶细胞的能力，这种现象称为免疫应答的MHC 限制性，主要参与提供外来抗原给T细胞毒细胞。而CD4+T细胞只能识别APC表面与自身相同的MHCII类分子和抗原肽段形成的复合物，即CD4+T细胞在识别外来抗原的同时，需识别II类抗原。1．3．3TCR识别抗原的机制TCR对抗原的识别起初有两种假说，一种是双识别(dau】recognition)假说，即在T细胞上存在两种不同特异性的TCR，一种TCR识别APC上自身MHC分子，另一种TCR识别APC上外来或自身抗原)肽段。第二种称为“自身修饰识别”falteredself)假说，即认为抗原与MHC结合，MHC构型会发生改变，TCR是识别经过构型改变了的MHC一抗原肽段复合体。T细胞的双重识别主要关键是T细胞对MHC的识别。T细胞在识别外来抗原的同时必须识别自身MHC抗原，T细胞才能被激活。不同T细胞亚群识别不同的MHC分子，Th细胞(CD4+、CD8+)识别MHCII类分子，Tc门『S细胞2(CD4+、CD8+)识别MHCI类分子，即Th细胞在应答过程中受MHCII类分子约束，Tc／Ts细胞受MHCI类分子约束。1．3．4免疫应答TCR⋯旦识别MHCI／抗原肽段，CTL就会与抗原肽特异性结合，并在经活化的Th细胞产生的自细胞介素(IL．2，IL．4，IL．5，IL一6，IL．9等)作用下，前体的细胞毒性T细胞(cytotoxiTcell，Wc)活化，增殖并分化为具有杀伤能力的效应性CTL(Tc)。比活化与靶细胞表面的抗原．MHCI类分子复合物紧密结合，然后使靶细胞发生进行性溶解。Tc对靶细胞杀伤破坏后，可完整无缺地与裂解的靶细胞分离，又可继续攻击其它靶细胞。在TCR识别MHcII，抗原肽复合体的同时，有多种细胞表面分子参与Th细胞的识别和活化。其中一种信息传递分子．CD3与TCR以共价键结合形成TCR．CD3复合物，在TCR识别抗原后，CD3分子将抗原的信息能传递到细胞内，启动细胞的活化过程。Th细胞上的的CD4分子作为MHCII类分子的受体与MHCII类分子结合，对TCR与抗原肽的结合起到巩固的作用。抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子。T淋巴细胞增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应性淋巴细胞，并产生多种细胞因子；B细胞增执分化为浆细胞，合成并分泌抗体，这些效应细胞和效应分子共同作用清楚抗原物质。1．4MHC的遗传特点HLA的遗传特点，具体表现在以下几个方面：1．4．1单倍型遗传HLA复合体中的基因是紧密连锁的，这些连锁在一条染色体上的等位基因很少发生同源染色体间的交换。在遗传过程中，同一条染色体上的一组基因作为一个完整 的遗传单位由亲代传给子代。同一条染色体上紧密连锁的不同位点的等位基因，称为单倍型(haplotype)。1．4．2高度多态性如果某座位上的最常见的等位基因频率小于0．99，也就是说至少有2％的个体为该座位的杂合体，这个座位被定义为多态座位。多态性(Polymorphism)是指处于随机交配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。根据共显性规则，若以每个个体2个单倍型上各有7个位点的等位基因计算，若均为杂合子，其编码的抗原为14个；均为纯合子，至少可编码7个抗原。按1991年第11届国际MHC专题讨论会公布的各位点上等位基因总数161个(A位点27个，B位点59个，c位点10个，D位点26个，DR位点24个，DQ位点9个，DP位点6个)，某些HLA抗原还存在着亚型(subtype)，例如DR位点上有一个cc基因，9个6基因，HLA．B27有8种亚型等，再加上这些型，单倍型的种类会更多。由此可见，在群体中除单卵孪生者外，很难找到2个单倍型相同者。1．4．3连锁不平衡在MHC中的各基因位点是紧密连锁的，若各位点的基因随机组合，由这些基因构成的某单倍型出现的频率应等于各个基因频率的乘积。但实际情况并非如此，连锁的基因并不是随机组合的，而是某些基因比其他基因能更多或更少地连锁在一起，即存在连锁不平衡(1inkagedisequilibrium)。在HLA复合体中己发现50对以上等位基因显示连锁不平衡，其产生的机制不清楚，但可能与下述原因相关：①某些单倍型具有选择优势；②群体迁移与混杂：③基因随机漂移：④近亲繁殖。1．5MHC产物与基因的分型方法HLA抗原基因具有高度的多态性，特别是HLAII类基因的第二外显子区核昔酸序列的高度变异，产生了众多的等位基因，如仅HLA—DRBl，位点就存在106个等位基因。HLA的多态性，决定了所表达的HLA抗原分子的多态性，也决定了HLA系统免疫反应的多样性和复杂性。HLA抗原多态性检测，己用于传统的器官、组织移植配型，疾病相关研究，人类学及法医学等领域，具有十分重要的意义。HLA抗原分型过去主要采用血清学和细胞学方法，随着PCR技术、基因芯片技术及分子生物学技术的发展，已建立从基因水平上进行HLA分型的技术。开始主要用于HLA．II类基因分型，最近几年也用于HLA．I类基因分型。国外HLA基因分型技术已基本成为组织器官移植中选择供受者的常规技术，并发现引起移植抗宿主病fgraftversushostdisease，GVHD)的HLA关键位点，对选择合适的供体，降低GVHD的发生率，提高移植物的存活率，均具有重要的意义。1．6MHC与疾病性状间的关系 自身免疫的过程是机体免疫系统对自身发生免疫应答的过程。在正常情况下，机体对自身抗原产生免疫应答(即免疫耐受)，只保护机体自身组织不受损伤。而免疫应笞的初始过程是Th细胞识别抗原导致T细胞活化的过程。这种识别要受到MHCII类分子的限制，换言之，机体免疫细胞在识别异己或自身抗原时，必须同时识别抗原递呈细胞表面的MHCII类分子才能被活化。MHC基因最显著的特征即是具有丰富的多态性，其多态性的差异决定个体免疫应答的不同。因此，推测HLA系统的特定等位基因是否在某疾病的发生上起藿要作用。可是，“关联”即使被确认，其机制也多是不明确的。虽然近年来随着分子生物学技术的应用与发展及对HLA抗原的生物学功能和结构的迸～步研究，积累了一些直接证据，但仍不充分；而且不同疾病与HLA关联的机制可能也不同，即使是同～种疾病也许还有其他发病机制。据不完全统计，迄今己研究了500余种疾病与HLA的关联情况，业已肯定有50多种疾病与HLA密切相关。目前HLA与疾病关联的研究热点主要集中在两个方面：一是IDDM(I型糖尿病)与DQ的关联。1987年，Todd等证实，导致与IDDM有强烈关联的HLA—DQ的等位基因为DQBI，其在发病中起重要作用的是编码的D肽链上第57位的天冬氨酸(Asp．57)。如果第57位上不是Asp，那么白人中IDDM的发病率将明显上升：反之，则发病率将明显下降。后来，在日本人群中再次证明57位的Asp作为一个抗性因子在IDDM发病中的重要作用。研究的另一个热点是HLA．B7与强直性脊柱炎的关联。1982年Schwimmbeck等通过计算机分析，发现HLA—B7分子超变区有6个氨基酸残基伊72—77)矛f1Klebsiella菌(认为与该病有关)中固氮酶分子的6个氨基酸残基完全相同，因此提出了分子模拟即共有表位在这～疾病中的作用。但从这段序列合成的小肽及制各的单抗，没有达到预期的效果。近年来，TAP及MHCII类基因启动予多态性与疾病关联的研究亦相当活跃。TAP与内源性抗原的加工和递呈相关，因而被认为可能与某些疾病的易感有关。启动子则与I类抗原的表达及表达的量有关，而且启动子的等位多念性可能引起“和B链产物量的不平衡，进而导致a和p链的错配(如DQ仳fD与DR[3组成一个“杂交分子”)，这种错配的分子有可能成为新抗原诱发自身免疫反应，导致自身免疫性疾病的发生。总之，特定的MHC以其特有的方式参与免疫应答，介导机体的免疫反应，与免疫应答和疾病抗性问具有相关性，但究竟是哪些MHC基因与免疫应答和疾病抗性问相关，其机理如何，尚属未知。随着对MHC复合体的研究以及运用分子生物学的深入了解和对此区域内基因的发掘，很可能更好的了解MHC复合体的抗病性的作用，也将为临床研究抗病育种和提高机体的抗病能力提供重要的依据。1．7研究MHO的目的意义6 MHC是一群位于染色体上的紧密连锁和高度多态的基因群，是迄今所知的最复杂，最具有多态性的遗传体系。其所编码的白细胞表面抗原在免疫识别、抗原递呈中起着极为重要的作用。MHC的等位基因多态性影响着免疫应答和肽的递呈，与自身免疫性疾病和许多感染疾病的易感性密切相关。研究MHC，对于探讨与MHC相关疾病的致病基因以及器官移植配型具有重要的理论意义和应用前景。 2前言2．1鸡的MHC基因的基本结构鸡的主要组织相容性抗原复合体最初由Briles等于1950年发现并首次论证为Ea—B血型基因座【6】，并于lO多年后证实为鸡的MHC，又称B复合体m】。Bloom和Bacon(1985年)报道鸡MHC位于8百万碱基对的第16号中等微小染色体上，其中6百万碱基编码rRNA，形成核仁组成区(NOR)，约2百万碱基编码MHC⋯01。对鸡的MHC抗原生化和重组分析表明Ho]，其由三种高度多态基因座组成，分别称为B．F、B．L、B-G。三者在染色体上排列紧密．有很强的连锁不平衡性。B．F、B．L、B—G分别产生MHC的I、II、III类抗原㈤，B—G抗原为禽类所特有[12,13,14,15】。B．F抗原：由B—F位点编码，是一种膜结合糖蛋白，由o【链和B微球蛋白组成，前者分子量为40-43kDa，具有多态性，后者为12kDa，两者呈非共价结合，在鸡中旺l、dz的肽结合区是多态性的，但与哺乳动物相比，结构有所不同。在不同的鸡中，相似或几乎没有区别。∞的表面几乎没有改变，仅有CD8+作用位点保留。B．F抗原存在于所有的有核细胞。B．L抗原：由B．L位点编码，为细胞膜表面的糖蛋白，EhⅨ链116】和B链旧通过非共价键结合的链组成。不同的是，鸡的Ⅸ链和B链基因可能相隔很远或位于不同的染色体上，而哺乳动物的0【链和D链基因紧密靠近㈣19·201。其中Ⅸ链分子量为30～32kDa，非多态性：D链为27～30kDa，具有丰富的多态性。其中。【】链和Dl链组成抗原结合区，CZ2链和D2链组成类免疫蛋白区。与哺乳动物相比，pI、p2区显示惊奇的分化程度相似性，只是B2比pI表现为更高的保守性【2”。p链的组成类似与哺乳动物的1I类6基因，有～个编码信号序列的外显子，有编码13-链PBR的多态性区域，有编码非多态性B2免疫球蛋白样的区域和2个编码细胞质的外显子，还有编码包括3’一uT的外显子，此区域中的Tapasin(TAP-associatedglycoproteinTAP相关糖蛋白)基因【2刈在内质网中通过介导B．F一132．微球蛋白引物与TAP的作用，从而在编码B—L分子的装配中起作用。2000年，Jacob等通过放大Tapasin基因侧翼序列发现，在Tapasin基因与RING3之间有较高的表达水平，在B—Lectin与Tapasin之间的B—L13基因表达水平较低[23】。B—L抗原存在于Ig+淋巴细胞【24】、法氏囊细胞、大部分浆细胞、单核细胞、巨噬细胞；而T细胞在MLC或分裂原刺激下可表达B—L抗原B。”J。B—G抗原：由B．G基因编码，具有丰富的多态性。近年来研究发现B—G抗原也参与一些组织相容性反应，可在免疫系统的非红细胞表达，如血小板、外周衄B淋巴细胞、T淋巴细胞、法氏囊细胞、胸腺细胞[24】，并且在红细胞上B-G抗原量比B—L抗原多几倍。B．G抗原在未降解时呈二聚体形式，约80—90kDa，在降解后是单一的为40～50kDa。B．G抗原可在孔雀红细胞上检出，也可在爬行动物、蟾蜍中检出B—G 抗原分子，但是在鸽子、鹌鹑的红细胞上未检出B．G分子【10,27】。2．2鸡MHCII链分子的功能鸡MHCII是与抗病力和免疫应答密切的一组基因群[28】，属编码个体特异性组织相容性抗原，在细胞介导免疫和体液免疫中均有重要作用‘291。细胞表面的MHCII抗原对每个个体都是特异的。控制MHCII介导的免疫方式有两个水平：细胞表面的分子介导和在免疫应答中的细胞融合13⋯。研究发现，无论是哺乳动物还是鸟类的MHCII都存有免疫限制性作用，包括T细胞协助功能和T细胞效应功能【3”以及抗原提呈细胞与T淋巴细胞的协作等口”。T细胞在对这些外来的并被呈递的抗原识别的同时，还要识别MHCll分子口”，说明TCR对抗原的识别还依赖于呈递MHCll分子。Vainio等用MHCII重组鸡证明，MHCII的I幔$fJ元件在B．L区域【34】。同时证明B．L区域的基因产物也是APC与T细胞作用的限制因子。B—F／L区基因控制着CD4+和CD8+细胞的数量以及二者的比例。研究表明，某些疾病的抵抗性和易感性与某些单倍体有关，如新城疫135,36】、马立克氏病‘37,38,39,40,41]、淋巴白血病‘42,43】、盲肠球虫病‘44,451、禽霍乱№471、劳斯氏肉瘤【48】等。近年来研究发现，MHCII除了在免疫应答中有重要作用外，还对家禽的生产性能如产蛋率f49】、孵化率、疾病易感性及体增重等有一定影响∽51,521，因而成为国际研究的热点。2．3鸡MHCII基因分子的研究意义大量研究表明：鸡MHCII链分子是呈现在免疫系统特定细胞表面的由0【链和p链非共价键相连组成的一组高度多态的跨膜糖蛋白口31，在T淋巴细胞识别抗原过程中起关键的作用，抗原只有在细胞内经加工处理并由MHC分子递呈到细胞表面后，才能被表达特异性抗原受体(TCR)的CD4+T淋巴细胞识别，诱导机体免疫应答。它的缺陷可能引起自身免疫病的发生。在病毒感染的疾病中，病毒的某些蛋白就是通过干扰MHCII的功能，影响机体正常的免疫识别口4。“。正是MHCII链分子以特有的方式调控特异性免疫应答，制约疾病的发生和发展，并介入免疫系统的发育，因此它在免疫学上具有重要的研究价值，成为近代分子免疫学和遗传学研究的热点。虽然国外对鸡MHCII链分子研究比较早，但是主要集中在遗传育种、基因分子结构等方面。而我国研究起步较晚，目前主要也是集中在遗传育种方面【511，而从免疫学角度针对鸡MHCII链分子研究不多。本实验主要通过基因的克隆和鸡的MHCIIa和p链基因的表达，并获取效价较高，特异性较强的多克隆抗体。通过对鸡MHCIIⅨ和p链进行初步的研究和探索，为获取MHCII链基因在鸡机体中作用机理，提高和增强鸡体的免疫力，更好地发展我国的养禽业奠定理论基础和实验方法手段。 3材料与方法3．1实验动物：3．1．1SPF鸡：由山东某鸡场提供。3．1．2昆明系小鼠：健康雌性，体重18～22g／只，2月龄，购自安徽医科大学实验动物中心。3．2质粒和菌种：3．2．1质粒：质粒pGEX一4T一1由中国科技大学生命科学学院惠赠。3．2．2菌种：大肠杆菌BL21菌株由中国科技大学生命科学学院惠赠。3．3主要工具酶及试剂：3．3．1UNIQ一10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、UNIQ一10柱式质粒小量抽提试剂盒、dNTP、Taq酶、低分子量标准蛋白等：购自上海生工生物工程公司。3．3．2M—MLⅣ反转录酶：购自Promega公司。3．3．3琼脂糖(西班牙产)、RNasin、^DNA／HindlII+EcoRIMarkers、EB、氨苄青霉索、溶菌酶、考马斯亮蓝R250、SDS、DTT、山羊抗小鼠HRP．IgG酶标抗体、TritonX一100：购自华美生物工程公司。3．3．4DNAMarkerDL2000、限制性内切酶(包括BamHI、EcoRI、Pstt、XhoI、SalI)和T4DNA连接酶：购自大连宝生物工程有限公司。3．3，5质粒纯化试剂盒、DNA清洁／PCR产物清洁试剂盒：购自杭州维特洁生化技术有限公司。3．3．6胰蛋白胨、酵母提取物：为OXID产品。3．3．7ConA：购自南京生兴生物公司。3．3-8淋巴细胞分离液、L．谷胱甘肽(还原型)：购自TBD公司。3．3．9谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B：为AmershamPharmaciaBiotech产品。3．3．10N一十二烷基肌氨酸钠、牛血清白蛋白(BSA)、Folin．酚试剂、福氏(不)完全佐剂：购自Sigma公司。3．3．11EDTA：上海试剂一厂产品。3．3．12N，N，N、，N、．四甲基乙二胺：上海前进试剂厂产品。3．3．13甘氨酸：中国医药上海化学试剂公司产品。3．3．14溴酚蓝：上海试剂三厂产品。3．3．15丙烯酰胺：湖北大学化工厂产品。3．3．16N，N、一亚甲基双丙烯酰胺：上海曹扬第二中学化工厂产品。3．4主要溶液的配制：10 3．4．1ConA：将ConA缓慢加入10mmol／LHEPES，1009mol／LCaCl2溶液(pH8．5)，溶解后保存在--20℃3．4．2．Hanks液：1)．原液A：NaCI1609KCI89MgS0429MgCl2。6H2029加蒸馏水至800mLCaCl22．8g加蒸馏水至100mL将以上两种溶液混合后，加蒸馏水至1000mL，并加2mL氯仿作为防腐剂，于4℃存放。2原液B：Na2HP04·12H203．049KH2P041．209葡萄糖20．009溶于800mL蒸馏水中，最后加入100mLO．4％酚红液。加蒸馏水至1000mL，并加2mL氯仿作为防腐剂，于4"C存放。按原液A：原液B：水=l：I：18的比例配成Hanks液，灭菌后于4。C存放。用时100mLHanks液加入35％NaHC03液，调pH7．2～7．6。3．4．3琼脂糖凝胶电泳所用溶液：50×TAE电泳缓冲液(贮存液)：Tris碱2429冰乙酸57．1mLO5mol／LEDTA(pH8．0)100mL加水到1000mL1×TAE电泳缓冲液(工作液)：Tris一乙酸O．04mol／LEDTAO．001mol／L加水到1000mL(用50×TAE稀释)EB：用水配成10mg／mL贮存液，用时工作浓度为0．599／mL。0．8％琼脂糖凝胶：100mLlXTAE缓冲液中加入O．89琼脂糖，加热至完全溶解稍冷却后，加入适量 EB使终浓度为0．5p．g／mL。3．4．4培养细菌所用溶液：Amp：用灭菌的双蒸水配制。LB液体培养基：胰蛋白胨贮存浓度：50mg／mL，工作浓度：100IItg／mL。酵母提取物NaC】用lmol／L的NaOH调pH至7．4汽灭菌20rain。LB固体培养基：10959】097．6，加双蒸水定容至1000mL，115"C高压蒸1000rnLLB液体培养基中加入159琼脂粉，充分混匀，调pH至7．4--7．6，115℃高压蒸汽灭菌20min。3．4．50．1mol／LCaCl2110％甘油(100mL)：1．19无水CaCl2，10mL甘油，加水到100mL，3．4．6lOmmol／LMgCl2-CaCi2(100mL)：80mmol／LMgCl2(I．6269)、20mmol／LCaCl23．4．7SDS．PAGE电泳所需溶液：2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)；0．5mol／LTris—HCl(pH6．8)2．0mL0一巯基乙醇1．0mL20％SDS(w～)2．0mL0．1％溴酚蓝(w／v)0．5mL甘油2．0mL双蒸水2．5mLTotal!O．0mLTris，甘氨酸电泳缓冲液(1000mL)：1Yis3．029甘氨酸18．89SDS19高压蒸汽灭菌。(0．2229)加水到100mL灭菌。加水至1000mLO．25％考马斯亮蓝R250染色液：取考马斯亮蓝R2502．59，溶解在1000mL甲醇：水：冰乙酸-45：45：10的溶液中用滤纸除去颗粒状物质，室温贮存。2 考马斯亮蓝脱色液：甲醇：水：冰乙酸=45：45：10，混匀室温贮存。10％SDS．PAGE分离胶(10mL)：去离子水4．0mL30％丙烯酰胺溶液3．3mL1．5moI／L"Iris．HCI(pH8．8)25mL10％SDS0．1mL10％过硫酸铵0．1mLTEMED0．006mL5％SDS．PAGE浓缩胶(3mL)：去离子水2．1mL30％丙烯酰胺溶液O．5mL10mol／LTris．HCI(pH6．8)0．38mL10％SDS0．03mL10％过硫酸铵O03mLTEMED0．003mL3．4．8蛋白提取、纯化所用溶液：BufferA溶液：Tris—HCl(pH8．0)50mmol／LEDTA1．0mmol／LDTT2．0mmol／LPMSF0．1mmol／L包涵体洗涤液：蔗糖309／LNaCI100mmol／LTris．HCl50mmol／LTritonX．1000．5％STE溶液：Tris．HCl(pH8．0)10mmol／LNaCl150mmol／LEDTA1mmol／LDTT2mmol／L裂解缓冲液：Tris．HCI(pH8．0)50mmol／Ll3 EDTA溶菌酶(即用即加)DTT(1rnol／L)溶液：2mmol几10099／mL用20mL0．01mol／L乙酸钠溶液(pH5．2)溶鳃3．099DTT，过滤除菌后分装成1mL小份贮存于一20。C。注意：DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。PMSF溶液：用异丙醇溶解PMSF成1．74mg／mL(10mmol／L)，分装成小份贮存于．20。C。谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B洗脱缓冲液：还原型谷胱甘肽l0mmol／LTris—HCI(pH8．0)50mmol／L谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B再生缓冲液：高pH值缓冲液：0．1mol／LTris—HCL+O，5mol／LNaCI，pH85低pH值缓冲液：0．1mol／LSodiumacetate+O．5moI／LNaCI，pH4．5PBS溶液：140mmol／LNaCI，2．7mmol／LKCl，10mmol／LNa2HP04，1．8mmol／LKH2POd3．4．9Folin．酚法测蛋白浓度常用试剂：溶液A(500mL)：109碳酸钠，29氢氧化钠，加双蒸水至500mL，4。C冰箱保存溶液B(100mL)：O．59硫酸铜，加双蒸水至100mL，4"C冰箱保存溶液C(100mL)：lg酒石酸钠溶于100mL蒸馏水中，4。C冰箱保存溶液D(5lmL)：用前配制，50mL溶液A，O．5mL溶液B，0．5mL溶液C溶液E：Folin一酚试剂，4℃冰箱保存。3．410ELISA实验所用溶液：包被液：Na2C031．59，NaHC032．99，加去离子水至1000mL，调pH9，6。稀释液(PBS)：NaCI8．Og，KH2P04O．29，Na2HP04-12H202．99，KCl0．29，加去离子水至1000mI一，调pH7．4。洗涤液(PBST)：NaCI8．09，KH2P040．29，Na2HP04‘12H202．99，KCl0．29，Tween200．5mL，4 加去离子水至1000mL，调pH7．4。底物液A(O．1mol／L柠檬酸溶液)：柠檬酸9．69，加去离子水至500mL。底物液B(O．2mol／LNa2HP04溶液)：Na2HP04·12H2035．85g，加去离子水至500mL。OPD底物应用液：A液4．86mL与B液5．14mL混合，加入OPD4mg，待充分溶解后加入30％(V／V)的H202509L，即成底物液。2NH2S04：去离子水300mL，浓硫酸50mL(缓慢滴加并不断搅拌)，加去离子水定容至450mL。生理盐水：O．859NaCI加100mL双蒸水，高压灭菌而成。3．5实验仪器：HZ一82气浴恒温振荡培养箱(江苏金坛市荣华仪器制造公司产品)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂产品)；HH．CP—T型C02恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司产品)；Hema4800PCR仪、Hema凝胶分析系统V2．0、UV．型紫外分析仪(珠海黑马医学仪器有限公司产品)：手提式紫外分析仪(UV．III型：北京新技术应用研究所)；倒置显微镜(重庆光学仪器厂产品)；DYY．28A夹芯式垂直电泳槽、DYY一6B稳压稳流定时电泳仪(北京市六一仪器厂产品)；LG．3A型冷冻离心机、LGl5-W高速离心机、LD4—2A低速离心机(北京医用离心机厂产品)；5412R微量冷冻离心机(eppendorf公司产品)；318MC型酶标仪(上海三科仪器有限公司产品)：DTG一160单盘分析天平(上海天平仪器厂)；JY92一II超声波细胞破碎机(宁波新芝科器研究所)：SZ一1型快速混匀器(江苏金坛市振兴仪器厂)；DK一8D电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司产品)；ZDX一35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂产品)；TS．100脱色摇床(北京市新技术应用研究所产品)；超净工作台(苏州净化设备厂)。3．6鸡MHCII基因cDNA的合成3．6．1引物设计p州参照GenBank中登录的鸡MHCIIa(登录号为AY357254)sgl0(登录号为$66480)mRNA序列及质粒载体POEX．4T．1的多克隆位点序列，应用PrimerPremier5．0软件分析鸡MHCa和0基因序列内的酶切位点，设计两对引物(其中Pl和P2为。链的上下游引物，P3和P4为0链的上下游引物) P1：5’一c鹊g堑盟gagatggcggtgctgagcggag一3’；BamHIP2：5’一gcg丝g§￡tcagagcCCCggtIggcg--3’SalIP3：5’--cg幽gccatggggagcgggcgcgtc--3’：ECORIP4：5’一gcg!￡ga￡ctaattcagcatccctggagcg--3’SalIPl、P2分别为鸡MHCIIo基因cDNA序列的上游引物和下游引物，Pl、P2的5’端分别引入与质粒载体相同的BamHI(ggatcc)和SalI(gtcgac)酶切位点并加上相应的保护碱基，P3、P4分别为鸡MHCIIB基因cDNA序列的上游引物和下游引物，P3、P4的5’端分别引入与质粒载体相同的EcoRI(gaattc)和SalI(gtcgac)酶切位点并加上相应的保护碱基，以便于将目的基因插入到载体PGEX一4T．1的多克隆位点处。经PrimerPremier5．0软件检测，所设计的引物不含有自身互补序列，不形成发夹结构，两条引物问不形成引物二聚体。PI、P2引物的理论跨幅为771bp，起始于鸡MHCIIa基因cDNA的atg，终止于tga，P3、P4引物的理论跨幅为798bp，起始于鸡MHCIIB基因cDNA的atg，终止于tag，分别涵盖了从鸡MHCIId和0基因从起始密码子到终止密码子的一个完整ORF。引物由上海生工生物工程公司合成，使用前用ddH20稀释至509rnol／L。3．6．2提取鸡脾淋巴细胞并诱导培养将5周龄的SPF鸡心脏采血处死，无菌取其脾脏，在冷Hanks液中剪碲，小心吸取含有单个脾细胞的上层液置于无菌的尼龙网上过滤，滤液经淋巴细胞分离液分离出鸡脾淋巴细胞。用Hanks洗涤淋巴细胞两次，再以RPMI一1640基础培养液洗涤一次，调整细胞浓度约为8．0×106个／mL，置于含1099／mLConA的含血清RPMI一1640培养液中，于40"C、5％C02条件下孵育，18h后收集鸡脾淋巴细胞。3．6．3提取鸡脾淋巴细胞中的总RNA用UNIQ．10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取鸡脾细胞中的总RNA。具体操作方法按试剂盒说明书：1)．ConA诱导培养16h的鸡脾细胞经计数后直接加入洁净的无菌离心管，然后室温离心5000rpm×5min，去上清。每1×107个细胞加O．5mLTrizol；2)．用lmL针筒，26．G号(6#)针头抽吸匀浆液两次，以剪切基因组DNA，然后直接从针筒中将样品转移到无菌15mL离心管中； 3)．力口入lOOpL氯仿／异戊醇(24：1)或氯仿，剧烈震荡混匀30s。用台式离心机室温离心12，000rpmx5min：4)．将上清液(约4509L)d、一心转移到无菌RNasc—ffeel．5mL离，心管里，加入150pL无水乙醇混匀；5)．小心将上步中的溶液全部转移到套放于收集管内的UNIQ一10柱中，室温放置2min，室温离心8000rpmxlmin；6)小，tl,取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加450mLRPESolution，室温离心10，000rpmx30s。重复上述步骤一次；7)．，J、心取出柱，弃去收集管中废液，将柱放回收集管中，室温离一Ii,10，000rpmxl5s：8)．／J、心取出柱，置于无菌RNase—flee1．5mL离心管中，于柱内膜的中央小心加入509L取蒸水，室温或55～80。C放罱2min。室温离心10，000rpmxlrain。离一II,管内的溶液即为鸡脾细胞总RNA样品，可立即使用或者一20。C保存。注意：以上操作均需戴一次性无菌手套且勤换，以防止RNA酶的污染。3．6．4合成eDNA第一链参照反转录试剂盒说明，以提取的鸡脾细胞总RNA为模板，用寡聚引物Oligo(dY)进行反转录。先在微量离心管中加入下列溶液：Oligo(dT)2．O旺mRNA10．09L70℃水浴5min，再冰浴5min后，分别加入下列溶液：5×buffer4．0uLdNTP2．OgLRNasin1．09LM-MLV1．09LTotal20．OwL上述溶液混匀后，再置于42V水浴中保温1h进行反应。结束后冰水浴中冷却2rain，即为cDNA第一链，可用于PCR扩增或保存于．20℃备用。3．6．5R11．PCR扩增以上述合成的cDNA为模板通过RT—PCR方法扩增鸡Ⅱ和B基因。在微量离心管中依次加入下列试剂(Pl、P2为n上下游引物，P3、P4为0上下游引物)：PCRbufferMgCl2dNTPP1(P3)¨LuL¨L“L7 P2(P4)O．81-tLcDNA4．09LTaq酶O59L甘油2．5pLDMSO1．31．tlddH208．29LTotal25．01al设灭菌的双蒸水为对照。扩增分别按以下设置程序扩增，d基因：94*01min，66"C1min，72。C2min，运行30个循环，72。C8min，4。Cforever；B基因：94。C1min，67。CImin，72。C2min，运行30个循环，72。C8min，4Vforever。扩增结束后分别取21_tLPCR扩增产物在1．5％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，观察结果。DNA琼脂糖凝胶电泳：用1×TAE电泳缓冲液配制浓度为1．5％的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，加EB(10mg／mL)至终浓度为O．5p．g／mL，混匀后倒入插好梳子的电泳胶模中，凝胶厚度在3-5mm之间。待凝胶完全凝固后(约30—45min)，小心拔出梳予，将凝胶置于盛有1×TAE的电泳液的电泳槽中，电泳液刚没过胶面(约lmm)。取适量待检DNA样品与适量的电泳上样缓冲液(即10×loadingbuffer，内含溴酚蓝)混匀，用微量加样器将上述混合样品加入上样孔槽中，90V稳压电泳。当溴酚蓝电泳至适当位置，紫外灯下观察并记录结果。3．6．6RT．PCR产物的单酶切鉴定应用PrimerPremier5．0软件分析已知鸡MHCIIO基因的cDNA序列在221bp处有EcoRI的酶切位点，13基因的cDNA序列在399bp处有PstI的酶切位点，取1001aL上述两个基因的RT—PCR产物于下列反应体系中进行单酶切鉴定：EcoRI1．0pL10xHbuffer2．0p．LⅡDNA12，09L+ddH205．009LTotal20．OuL PstI1．0gLIO×Hbuffer2．0gL0DNA12．OgLddH205．009LTotal20．OuL37。C水浴反应3h后，取5此反应产物于1．5％琼脂糖凝胶中电泳检测。3．67RT-PCR产物的回收RT—PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳后，切下大小约771bp的。基因和798bp的$基因目的基因片段，用DNA凝胶提取试剂盒回收。具体方法按试剂盒说明书操作：1)．切下所需凝胶，置于一灭菌的1．5mL微量离一11,管中，称量凝胶的重量。凝胶重量作为一个凝胶体积(100mg=1009L)根据凝胶浓度按下表所提供的参数加DE—A溶液。凝胶浓度DE。A溶液体积≤1．O％3个凝胶体积≤15％4个凝胶体积≤2．0％5个凝胶体积2)．混合均匀后于75。C力I热，间断混合(摇晃)，直至凝胶完全融化(约6-8min)，每管再加0．5个DE—A体积的DE．B溶液，混合均匀后转移到含滤膜的DNA制备管中，3600rpm离心1rain，弃滤液。3)．将制备管置回离心管中，加O．5mLw1溶液，3600rpm离一Ii,30s，弃滤液。4)．将制备管置回离心管中，加0．7mLW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用0．7mLW2溶液洗一次。5)．将制备管置回离心管中，最高速度离心lmin。最后将制备管置于洁净的15mL离心管中，在DNA制备膜中央加259L水(60。C预热)，最高速度离心lmin，洗脱DNA。所得滤液即为纯化的DNA。．20。C保存备用。3．7鸡MHCIIa和B基因的原核表达质粒构建和克隆3．7．1鸡MHCIIn和BcDNA的双酶切取少量上述回收产物经琼脂糖凝胶电泳检测并估算含量后，在下列反应体系中进行双酶切：a基因的体系为BamHISalI1．50uL19 10×TbufferQcDNAddH，0TDtal3．00uL12．OuL2OOuL20．0uLB基因的体系为：EcoRI1．50uLSalI】．50uL10×Hbuffer3．00¨LBcDNA20．OuLddH204．00uLTotal30．OpL混匀，37"C水浴3．0h，双酶切完毕后立即用PCR清洁试剂盒进行纯化。3．7．2鸡MHCIIⅡ和BeDNA双酶切产物的纯化鸡a和13链基因的cDNA双酶切产物用DNA清洁／PCR产物清洁试剂盒进行纯化。具体操作方法按试剂盒说明书：1)．酶切反应液中，加3个体积的PCR—A溶液(若PCR．A溶液不足100pL，加至100¨L)；混合均匀后转移到DNA制备管中，将DNA制备管嚣于2mL离心管中，3600rpm离心lmin，弃滤液。2)．将制备管置回离心管，加0．5mLW1溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。3)．将制各管置回离一心管，加0．7mLW2溶液，3600rpm离，心30s，弃滤液。4)．以同样的方法再用O．7mLW2溶液洗涤一次。将制备管置回离心管，最高速度离心lmin，超净台内吹风机吹5．10min。5)将制各管置于洁净的15mL离心管中，在DNA制备膜『F中央加预热的65℃双蒸水25I_tL，13，000rpm离心lmin收集滤液即为纯化的DNA，用以与质粒PGEX．4"1、．1连接。6)．琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物并估计含量。37．3pGEX．4T．1质粒的抽提【57J大肠杆菌BL21中的pGEX．4T．1质粒用质粒抽提试剂盒提取。具体操作按试剂盒说明书进行：1)．用无菌牙签挑取含质粒pGEX·4T-1的大肠杆菌单菌落接种于3mL含Amp(100¨g／mL)的LB液体培养基中，37℃震荡培养230Fpm×12～16h。21．取菌悬液，加到2只微量离心管中，每管1．5mL，离心12，000rpm×15s，彻底20 去除上清。每管加入lOOpL冰冷的SolutionI，用枪头或震荡器充分悬浮细菌。3)·每管加入1009LSolutionlI，立即上下颠倒5次，使细菌裂解，室温放置lmjn。4)·每管加入430此SolutionIII，立即上下颠倒5次。使之充分中和，室温放置2mjn。高速离心12，000rpm×2N5min。5)．吸取上清转移到套放于2mL收集管的UNIQ一10柱中，室温离，Ii'8000mm。1rain。6)．弃收集管中的废液，将UNIQ．10柱放回收集管中，吸取500uLWashSolution到UNIQ一10柱，离心10000rpmx30s。重复上述步骤一次。7)-弃收集管中的废液，将uNIQ一10柱放回收集管中，离心10，000rpm×15s以取出残留的WashSolution。8)一每tYNIQ一10柱放回i．5mL离心管中，每管加40taLddH20，室温放置2min后，离心10，000rpm×1mina离心管中洗脱下来的溶液中即为所需的PGEX一4T一1质粒DNA，取少量于O．8％琼脂糖凝胶电泳中鉴定，其余一20。C保存备用。37．4pGEX-4T-1质粒的双酶切在微量离心管中依次加入下列试剂：EcoRI50．09LXholI1．509L10。Hbuffer3．009LpGEX一4T～18．09LddH206．00HLTotal30．09L该体系适用0【和PGEX．4T．1双酶切；EcoRI1．509LSaII1．5％L10。Hbuffer3．00／』LpGEX一4T一12409LddH200．00此Total30．09L其中该体系适用于口和pGEX．4T．1质粒的双酶切。混匀，于37。C水浴2h，双酶切完毕后立即用DNA凝胶提取试剂盒进行网收纯化。3．75pGEX一4T-1质粒的双酶切产物的纯化pGEX一4T一1质粒的双酶切产物经0．8％琼脂糖凝胶电泳检测后，切uF目的基因片 段，用DNA凝胶提取试剂盒回收，方法同前，再电泳检测并估算含量。3．7．6鸡MHCd和B片段与载体pGEX．4T．1的连接设罨两管：在A、B管中分别按3：1摩尔比加入上述经EcoRI和XholI双酶切和经EcoRI和SalI双酶切后纯化的鸡a和13基因cDNA(2．7．1)与pGEX．4T一1(2．7．4)，两管中都加入适量的T4DNA连接酶，16℃连接过夜。具体反应体系如下：A管：TdDNALigase1．OIaL10xT4DNALigaseBuffer1．5uLo双酶切产物10．O“LpGEX．4T一1双酶切产物2．5pLTotal15．0pLB管：T4DNALigase1．0btLl0xT4DNALigaseBuffer1．51aL0双酶切产物10．0p．LpGEX一4T一1双酶切产物2．5rtLTotal15，0“L3．7．7转化宿主面BL213．7．7．1大肠杆菌BL21感受态的制备【57】1)．挑取BL21单菌落于3mLLB液体培养基中，37。C230rpm振摇培养过夜a2)．次日，将上述培养过夜物1：100稀释，继续培养290rpmx2～3h，至大肠杆菌的对数生长期。31．取出3mL细菌培养物于冰浴中作用10min，离心8000rpm×3rain，弃上清，沉淀悬于5009L预冷的O．1mol／LCaCl2一MgCl2溶液中。41．离心，沉淀再悬于500I．tL预冷的O．1mol／LCaCl2一MgCl2溶液中，冰浴30rain。5)离心，沉淀悬于160l_tL预冷的01mol／LCaClffl0％甘油溶液中，按每管50BL迅速分装于灭菌并预冷的微量离心管中，直接用于转化或保存于一70。C备用。3．7．7．2重组质粒的转化11．取3管(标记为I、II、III管)感受态细胞(50rdd管)立即冰浴10min。21．I管加入A管中的连接液9jaL：II管加入B管中的连接液9此。I管、lI管冰浴30min后转入42|。C水浴90s，接着迅速冰浴2min。3)．每管加950皿LB液体培养基，376C振荡培养160rpm×45rain。 4)．离心，每管再加2009LLB液体培养基溶解沉淀。5)．分别从I管、II管中取lO％L转化液涂布于含Amp(100pg／mL)的LB琼脂板上，各涂一块板，分别标记为I、II板。另取III管中的感受态细胞涂于不含Amp的LB琼脂板上，标记为III板用以检测感受态细胞的状况。6)．待其表面干燥后37℃倒置培养12～16h，至出现转化菌落。3．7．7．3阳性克隆的筛选挑取具有Amp抗性的菌落，接种于3mL含Amp(100“g／mL)的LB液体培养基，37。C、230rpm培养12～16h。用质粒提取试剂盒提取重组质粒，方法同前。然后取2此于O．8％的琼脂糖凝胶电泳检测，慢泳质粒为可疑重组质粒。3．7，8重组质粒的酶切鉴定用EcoRI和XholI对筛选的可疑重组质粒pGEX一4T一1／n和用EcoRI和SalI对筛选的可疑重组质粒pGEX一4T．1／B分别进行双酶切，观察是否有与插入的鸡(t和0cDNA片段大小一致的片段被切下。相应的重组质粒的酶切鉴定反应体系：EcoRI1．509LXholI1．50uL10xHbuffer3，009LpGEX·4T-1／o18．0pLddH20600uLTotal30．09L其中该体系适用。和质粒的双酶切：EcoRJ1．，UuLSalI1．5％L10xHbtlffer3．OOuLpGEX-4T一1／B24．09LddH20O．00止Total30．0uL其中该体系适用于B和PGEX一4T—l质粒的双酶切。将以上各管置于37。C水浴3h，然后于O．8％的琼脂糖凝胶中电泳检测。3．7．9重组质粒插入片段的DNA序列测定经双酶切鉴定过的重组质粒pGEX一4T．1／a和pGEX·4T-1／B送上海生工生物工程公司测序，测序结果用Blast软件进行同源性分析。3．8鸡MHCIIⅡ和13基因的原核表达与鉴定 3．8．1重组质粒pGEX一4T一1／Q和pGEX．4T．1／B的诱导表达【57]1)．分别从含对照菌(pGEX一4T—l转化阳性的BL21大肠杆菌)和重组菌(pGEX·4T一1／Ⅱ和pGEX一4T-1／13转化阳性的BL21大肠杆菌)的平板中挑取单菌落，接入3mL含Amp(10099／mL)的LB培养液，37。C静置培养过夜。2)．取50tiL过夜培养物接种于5mL含Amp(10099／m1)的LB培养液，37。C振荡培养2～3h，至对数中期(A550=O．5～1．0)。31．每管吸出lmL未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，为未诱导菌做对照用。在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1．0mmol／L，37℃继续培养，4h后收集诱导培养的细菌。4)．每管的对照菌、诱导菌及未诱导菌各取lmL，室温高速离心lmin。51．沉淀悬于1009L1×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热3min，室温高速离心Imin，取上清上样于10％SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。3．8．2GST．a和GST．13融合蛋白的SDS。PAGE电泳鉴定1)，准备：电泳玻璃板用去离子水洗净凉于后，戴上手套，用无水乙醇的棉球擦拭玻璃板两面及胶条、梳子等，安装待用。2)，10％分离胶(10mL)的灌制：配制lOmL10％的分离胶，分离胶配好后充分混匀，立刻灌注两玻璃板的间隙，留出灌注浓缩胶所需空闯(梳子齿长再加lcm)，上面覆盖一层水，将凝胶垂直放置在室温F。3)5％浓缩胶(3mL)的灌制：当分离胶聚合完全后，弃去覆盖层液体，吸净残留水滴，并配制3mL5％的浓缩胶。在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，插上梳子，将凝胶垂直放置在室温F。浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，电泳槽内外槽罩分别加入Tris．甘氨酸电泳缓冲液。排除凝胶底部两玻璃板之间的气泡，用于电泳。4)．样品的制备：各取lmI，培养好的诱导菌、未诱导菌、对照菌离，IL,，沉淀用l×SDS凝胶加样缓冲液悬浮，IOO。C)jH热3rain，室温高速离心lmin，上清即为样品。5)．加样接通电源：按一定顺序加样，每孔109L，做好记录。接通电源，浓缩胶所加电压为8V／cm，当染料前沿进入分离胶后，提高电压至15V／cm，继续电泳直到染料前沿达到分离胶底部，关闭电源。取下玻璃板，并轻轻撬开，切下凝胶左下角以示标记。6)．染色：将凝胶置O．25％考马斯亮蓝R250染液中，室温轻轻摇动，染色4h以上。 7)．脱色：取出已染色的凝胶，置于脱色液中，室温平缓摇动，频繁更换脱色液，赢至蛋自条带清晰可见，蓝色背景消失为宜。8)．记录：将凝胶结果留做永久性实验记录。3．8．3GST—n和GST．B融合蛋白的可溶性鉴定㈣1)．IPTG诱导培养10mL含重组质粒pGEX一4T．1／o和B的BL2l菌液，诱导4h后收集菌液。2)．离心12，000rpm×20秒并用裂解缓冲液悬浮(2509L裂解缓冲液／mL菌液)。3)．30。C恒温放置15min，超声波超声，4。C超声两次，每次lO秒钟。4)爿每上述裂解液离心12，000rpm×2min，移上清于一个台有等体积2×SDS凝胶加样缓冲液的新离心管中，这是可溶蛋白提取物。5)尉不可溶蛋白提取物用100“L1×SDS凝胶加样缓冲液悬浮沉淀。加热，通过10％SDS．PAGE分析10pL样品中的可分量。3．8．4GST—n和GST．B诱导表达条件的优化3．8．4．1确定诱导剂IPTG的最佳浓度11．挑取单菌落接种于3mL含Amp(10099／mL)的LB培养液中，37。C静置培养过夜。21，按1：100比例稀释至5mL含Amp的LB培养液中(共5组)，继续培养2～3h至OD550=O．5～1．0。3)．每组加入IPTG分别至终浓度O．4mmol／L、O．6mmol／L、0．8mmol／L、1．0retool／I，、1．2mmol／L，于37。C继续培养。4)．4h后分别取lmL样品放于微量离心管中，室温高速离心lmin。5)．沉淀悬于1009L1×SDS凝胶加样缓冲液，100。cjjH热3rain，室温高速离心lmin，10％SDS．PAGE电泳鉴定，确定最佳诱导剂浓度。3．8．4．2确定最佳的诱导时间挑取单菌落接种于3mL含Amp(1001』g／mL)的LB培养液中，37。C静置培养过夜，按1：100比例稀释至5mL含Amp的LB培养液中(共5组)，继续培养2～3h至OD55萨O．5～1．0，加入IPTG至终浓度为lmmol／L，分别于37。C继续培养211、311、4h、5h、6h，各取lmL样品放于微量离心管中，室温高速离心1rain。沉淀悬于100p,L1×SDS凝胶加样缓冲液，100。C力H热3rain，室温高速离，11,lmin，10％SDS·PAGE电泳鉴定，确定最佳诱导时间。3．9GST．n和GST邛融合蛋白的大量提取与纯化 3．9．1诱导大量表达1)．挑取含重组质粒pGEX一4T一1／a和pOEX．4T一1／B的BL21单菌落接入5mL含Amp(10099／mL)的LB培养液，于37。C静置过夜。2)取5mL过夜培养物接入500mL含Amp(10099／mL)的LB培养液，在2L摇瓶中于37。C振荡培养2～3h，至对数中期(OD550=0．5～1O)。3)．吸出1mL未诱导培养物到1．5mL离心管中离心lmin，弃上清，沉淀用1001』L2XSDS凝胶加样缓冲液悬浮。4)．剩余培养物加IPTG至终浓度为1．0mmol／L(alpha)和1．0mmol／L(beta)，37℃振摇培养4h。从中吸取lmL培养物(诱导样品)到1．5mL离心管中离心1rain，弃一h清，沉淀用1009L2XSDS凝胶加样缓冲液悬浮。5)．未诱导样品和诱导样品100。CJjH热3rain，离心lmiu。各取109L上清进行10％SDS—PAGE，考马斯亮蓝染色，分析蛋白诱导水平，然后进行GST。a和GST—B融合蛋白的大量提取。3．92GST．Q和GST．13融合蛋白的提取与纯化3．9．21包涵体的提取、溶解及复性陬6叫(十二烷基肌氨酸钠法)收集诱导表达4h的菌体，用0．01mol／LPBS(PH7．4)洗涤3次，用30mLBufferA重悬，．20*(2反复冻融3次，超声波法裂解细菌。裂解液4"C离心12，000rpm×5rain。沉淀部分用包涵体洗涤液洗涤2次，用30mLSTE重悬沉淀，加入十二烷基肌氨酸钠，终浓度为159／L，超声150W×3min，离心除去不溶物。上清用0．01mol／LPBS(pH7．4)透析48h，即为GST．o和GST—D融合蛋白。用于纯化的融合蛋白须加入TritonX—100，终浓度为l％。3．9．2．2GST．Ⅱ和GST．B融合蛋白的纯化(谷胱甘肽亲和层析法)用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B进行纯化，具体按说明书操作：11基质的制备：摇晃盛有GlutathioneSepharose4B的瓶子，重悬基质。用移液管移适当的浆液至离心管内以备用(提供的琼脂糖凝胶4B为浓度75％的匀浆，以下步骤将使浆液浓度变为50％。每lmL柱床体积需要用1．33mL最初的谷胱甘肽琼脂糖匀浆。lmL柱床体积能结合约5mgGST蛋白)。离心沉淀基质5009×5rain，小心弃去上清。每1．33mL最初分配的谷胱甘肽琼脂糖匀浆再用10mL冷(4℃)的PBS清洗，以洗涤上述的谷胱甘肽4B，倒置混匀。5009X5rain离心沉淀基质，小心弃去上清。每1．33m1．最初分配的谷胱甘肽琼脂糖匀浆加lmLPBS，使之成为50％匀浆。21．GST融合蛋白的纯化：每5mg保存在PBS+1％TritoalX．100中的GST／o和GST／0加2mL用PBS平衡的50％的G1utathioneSepharose4B浆液，室温下轻摇30min。离心悬液5009×5min， 沉淀基质，弃去上清。用10倍柱床体积的PBS洗GlutathioneSepharose4B沉淀(每柱床体积=O．5×所用的50％GlutathioneSepharose浆液的体积)。离心悬液5009×5rain，沉淀基质，弃沈液。重复洗涤两次，共洗3次。对于沉淀的基质，每毫升柱床体积的GlutathioneSepharose4B加1．0mL洗脱缓冲液。轻轻混匀重悬基质，室温(22～25。C)放10rain洗脱掉基质上的结合物。离心悬液5009X5min，沉淀基质，移走上清，保存在一个新的离一tl,管内。再重复洗脱和离心2次，收集3次洗脱液。SDS．PAGE电泳检测纯度。3．10GST．Ⅱ和GST—B融合蛋白的定量(Folin一酚法测蛋白浓度)3．10．1制作标准曲线用牛血清白蛋白(BSA)做为标准蛋白。准确称量10．0mg标准蛋白溶于5．0mL生理盐水中，配成2mg／mL的浓度，然后以2mg／mL为初始浓度在酶标板上进行2倍稀释，共稀释11个孔，留一孔不含BSA用来做阴性对照。各浓度取3091．(两个重复)，与15％LD液混匀，室温置10rain，迅速加入151aLE液，混匀后置37。C水浴30rain，酶标仪测OD620值，以蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。3．10．2检测蛋白浓度取待测蛋白(包涵体蛋白及纯化的融合蛋白)做适当稀释，按上述方法测吸光值，并根据标准曲线计算样品的蛋白含量。3．11鼠抗鸡MHCIIQ和B多克隆及鉴定抗体的制备3．11．1抗原及抗原乳化抗原即为本论文2．9．2．1中所述的透析后的GST—a和GST—p融合蛋白。抗原的乳化：弗氏(不)完全佐剂微加热，用注射器抽吸2mL移入灭菌青霉素瓶内，缓慢滴入2mL重组蛋白抗原GST．O和GST，B，用注射器反复抽吸，然后观察鉴定乳化效果。乳化剂鉴定：将上述弗氏(不)完全佐剂抗原滴于冷水中，液滴仍保持完整，聚成滴状，浮于液面，即表示完全乳化。3．11．2鼠多抗的制备实验前分取少量小鼠血，分离血清留待阴性对照。分别将GST—Ct和GST—B重组融合蛋白用等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫7只普N_d、鼠，每只10099抗原，皮内多点注射。初次免疫。15天后用弗氏不完全佐剂充分乳化的GST-o和GST—D抗原进行第二次免疫，剂量同上，注射于皮下。二免一周后尾静脉采血琼扩检测效价，隔一周进行第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射。三免一惆后眼球采血，分 离血清。并对抗体的效价和特异性进行鉴定。3．113免疫血清效价测定3．113．1琼脂双向免疫扩散法检查抗血清的纯度和效价以1％生理盐水琼脂加热融化后制板。待琼脂凝固后，钻梅花孔。中央fLDr]入GST—o和GST．B融合蛋白(免疫原)，周围加入倍比稀释的鼠抗血清。将琼脂板置于湿盒内，在室温下扩散24～48h，观察结果。3．1"．2间接ELISA法检测抗体效价间接ELISA法确定抗原包被量：11将自制纯化的重组融合蛋白用包被缓冲液稀释成1：25、I：50、1：100等不同浓度横向包被96孔酶标板，每孔1009L，4℃过夜。2)将板内液体甩干，用洗涤液洗3次，甩干。3)．鼠免疫血清按1：100、1：400、1：1600、1：6400用PBS稀释，纵向加样，每孔10％L。鼠免疫前血清按同样方法稀释，纵向加样，每孔1009L，作为阴性对照。41．37|。C温箱孵育30min，同前洗涤。5】．每孔加1：1000稀释的山羊抗小鼠IgG．HRP的酶标抗体稀释液1009L，37。C温箱孵育30min，同前洗涤。61．每孔加OPD底物1009I。室温避光静置15min。每TLDN终止液1009L，轻轻振摇，酶标仪测OD492值，P／N>一2．1者判为阳性。间接ELISA法测鼠多抗效价：11，的重组融合蛋白用包被缓冲液稀释成1：50包被96孔板，每孔100肛L，4。C过夜。21甩干，用洗涤液洗3次，甩干。3)按1：250、1：1000、1：4000、l：16000、1：64000、1：256000、1：1024000、】：4096000用PBS稀释，每孔100”L，鼠免疫前血清按同样方法稀释，纵向加样，每孔100BL，作为阴性对照。4、．温箱孵育30min，同前洗涤。51．1：1000稀释的ttRP标记的羊抗鼠IgG的酶标抗体稀释液IOOBL，37℃温箱孵育30min，同前洗涤。61．OPD底物lOOgL，室温避光静置15min。每孔加终止液100pI。，轻轻振摇，酶标仪测OD492值，P／N)2．1者判为阳性。 4结果与分析4．1鸡MHCIIQ和13基因的克隆与鉴定41．1提取鸡脾淋巴细胞中的总RNA细胞内大部分RNA为rRNA。凝胶电泳总RNA时，会得到3种RNA中最显著rRNA分子特征带型28s．18s，5s，约占总RNA的80％。用UNIQ一10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取鸡脾细胞中的总RNA，采用常规的琼脂糖凝胶电泳，结果如图4．1，肉眼观察可见28s条带和18s条带，说明没有降解，实验结果比较理想。本实验没有观察到RNA典型的28s，18s，5s三条带电泳带，只出现了部分的5s带。这可能与具体的实验操作有很大关系。图4-1鸡脾细胞抽提的RNA电泳结果Figore4-1RNAproductsfromchickenspleenbygeI—endonuc『ease4．12lit．PCR扩增的鸡MHCIIⅡ和B基因从10pJmLConA诱导培养16h的鸡脾细胞中提取总RNA，再用反转录酶将其中的mRNA反转录成cDNA，接着以cDNA为模板用自行设计的引物进行Rf'-PCR，RT—PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示琼脂糖凝胶上在750bp和1000bp问有一特异性DNA条带，分别与预期鸡MHCIICt分子大小为771bp和0分子大小为798bp相一致，可初步判定我们已从鸡脾细胞内分离到鸡MHCIIⅡ和D基因，见图4．2(泳道1)和图4—3(泳道3)。图4-2RT—POR扩增产物及其酶切鉴定结果 1．RT—PCR产物；2RT—PCR产物的EcoRl酶切结果；3DNA分了量标准Figure4-2dentificationofRI—PORproductandtheirfragmentsbyendonucleaSeLanelProductofRT—PCR：Lalle2PjoctucLsofRT—PCR／EcoRI：Lal／e3．DNAMatkelDL2000图4-3R卜POR扩增产物及其酶切鉴定结果1DNA分子量标准：2RT—PCR产物的PstI酶切结果：3．RT—PCR产物Figure4-3dentificationofRT—PCRproductandtheirfragment$byendonucIease，a13e1DNAMazkerDL2000：【．a[1e2ProdLtotsofRTPCR／PstILane3ProductofRT—PCR4、1、3鸡MHCIIn和B基因RT—PCR产物的单酶切鉴定应用PrimerPremier5．0软件分析已知的鸡MHCIIo和B基因序列，发现a基因在22lb口处有一EcoRI酶切位点，p基因在399bp处有一Pst[酶切位点；分别用内切酶EcoR!和Pstl对我们所获得的。和B基因的RT．PCR产物进行酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示Q酶切的两条DNA片段大小分别为221bp和550bp(图4．2泳道2)，两者总长度约为77]bp，B酶切的两条DNA片段大4'者ll为399bp(图4．3泳道2)，两者总长度约为798bp，与预期酶切结果相符。实验表明，经RT—PCR扩增所获得的DNA片段的酶切位点与OenBank中登录的鸡MHCIIO和B基因一致，进一步证明我们所分离的基因为鸡MHCII。和B基因。4．14鸡MHCIIo和B基因的克隆与重组质粒pGEX一4T一1／Cl和B的双酶切鉴定j4-获得的鸡MHCIIa和B基因RT．PCR产物和质粒pOEX一4T一1分别用相应的内切酶EcoRI、XholI(Q)和EcoR]、Sail(B)双酶切并纯化后，二者在T4DNA连接酶作用下连接】2～[8h，连接产物转化大肠杆菌BL21。转化液涂布于含Amp的LB固体培养基I二，以期利用Amp抗性来筛选阳性克隆，结果在含Amp的LB培养板上生长出数十个A，np抗性菌落。随机挑取其中3个菌落培养增殖并用质粒抽提试剂盒抽提质粒，发现有～个慢泳质粒(由于合有外源片段，使重组质粒在电场中泳动速度比不含有外源片段的质粒慢，故名。图略)，命名为pOEX一411—1／a和pGEX-4T-1邝，该两个质粒都为可疑重组质粒。用EcoRI、XholI(o)和EcoR!、SatI(13)对质粒进行双酶切鉴定，双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，pGEX一417-1／n此质粒经EcoRI、xhoIr取酶切后，产生两条DNA条带，大小分别约为4．9kb和O77Ikb(图4—4泳馗 2)，其正好与质粒pGEX一4T-】和鹏d基因片段大小相符。pGEX．4T．I／口此质粒经EcoRI、Sail双酶切后，产生两条DNA条带，大小分别约为4．9kb和O798kb(图4-5泳道5)，其正好与质粒pGEX一4T一1和鸡B基因片段大小相符，未连接目的基冈的质粒pGEX一4T一1经双酶切后只有一条约5kb左右的DNA条带(圉4．4泳道3和图4-5泳道4)。这表明鸡MHCIIa和B基因的cDNA已被成功克隆，并构建了重组质粒pGEX一4T一1／o和pGEX一4T一1／B。图4-4pGEX一4T一1／Ⅱ的双酶切鉴定结果1重组质粒PGEX一4T一1／a：2．pGEX-4T一1／Ⅱ的EcoRI+Xhol双酶切结果：3pGEX一4T一1的EcoRI+XholI双酶切结果；4空质粒pGEX4T一1：5、7DNA分了量标准：6PCR产物Figure4—4IdentificationofpGEX一4f一1／obyendonuoIeaseLane1pGEX--4T一1／121：Lane2pGEX一4T一1／ddigestedbyEcoR{+Xhol：Lane3pgEX一4T1digestedbyEeoR十Xh01I：Lane4pGEX一4T一1：Lane5、7．DNAMaikel-：Lane6productofPCR图4—5pGEX一4r—f／目的双酾切鉴定结果1、7．DNA分子量标准；2重组质粒pGEX4T1／B；3空质粒p6EX4T一1；4pGEX一4T一1的EcoRI+Sali双酶切结果i5pGEX4卜t／B的EcoRI+Sal双酶"J结果：6PCR产物。Fjgore4—5dentifIeatioRofpGEX一4T一1／Bbyeadonucleaseal／e1、7DNAMaIkel：Lane2．pGEX-4T—l／目；Lane3pGEX一4T—1．Lane4pOE)c一4TldigestedbYgcoRI+SalI：Lane5口GEX4T-I／日digestedbyEcoRI+SalI：Lane6PloductofPCR41．5重组质粒pGEX一4T．1Iq和pGEX-4T一1／B中鸡Ⅱ和B基因的DNA序1)lJ澳lJ定对重组质粒pGEX一411．1／o和pOEX-4T．1／B中的鸡q和p基因进行了cDNA全序列测序鉴定，测序彩图见附录A(q)和附录B(B)，结果表明所克隆的鸡。和p基因都含有一个完整丌放阅读框(ORF)，分别编码771和798个核苷酸。GeneBank登录31 的鸡。(登录号：AY357254)的ORF为771个核苷酸，二者相比较，所克隆的鸡a基因(图4—6)，二者只有四个核苷酸的差异，同源性为99％，导致2个氨基酸的改变(图4．7)。同样，GeneBank登录的鸡B基因(登录号：$66480)的ORF为798个核苷酸，二者相比较，所克隆的鸡13基因(图4．8)，二者有42个核萤酸的差异，同源性为95％，导致27个氨基酸的改变(图4-9)。因此，序列分析证明已成功的克隆出鸡a基因的cDNA和鸡0基因的eDNA。1AgagatggcggtgctgagoggagccgcggtgccactgctcctcctgggggtcctggggggcBgagatggcggtgctgagcggagccgcggtgccactgctcctcctgggggtcctggggggc61．AgtcggggccgtcctgaagccgcacgtgctgctgcaggccgagttctaccagcgttcggaaBgtcggggccgtcctgaagccgcacgtgctgctgcaggccgagttctaccagcgttcggaa121．A．ggcccggataaggcgtgggctcagttcggttttcacttcgacgcggacgaactgttccacB．ggcccggataaggcgtgggctcagttcggttttcacttcgacgcggacgaactgttccac181．AgtggagttggacgccgctcagaccgtatggaggctgcccgaattcggccgcttcgccagcB．gtggagttggacgccgctcagaccgtatggaggctgcccgaattcggccgcttcgccagc241、A．ttcgaggcccagggagccctgcagaacatggccgtgggcaagcagaacctcgaggtcatgB．ttcgaggcccagggagccctgcagaacatggccgtgggcaagcagaacctcgaggtcatg301．A．atcggcaactccaaccgctcccagcaggacttcgtcacccccgagctggctctgttccccB。atcggcaactccaaccgctcccagcaggacttcgtcacccccgagctggctctgttcccc361．A．gccgaggcggtgtccctggaggaacccaacgtcctcatctgctacgccgataagttttggB．gccgaggcggtgtccctggaggaacccaacgtcctcatctgctacgccgataagttttgg421．A．cctccggtggccaccatggagtggcgccgcaatggggcggtggtctccgagggggtttacB．cctccggtggccaccatggagtggcgccgcagtggggcggtggtctccgagggggtttac481．A．gacagcgtctattacggacggcccgacctcctcttccgcaagttctcctatctgcccttcB．gacagcgtctattacggacggcccgacctcctcttccgcaagttctcctatctgcccttc541．AgtaccccaaaggggagacgtttacagctgcgccgtgaggcactggggggccgagggacccB．gtaccccaaaggggagacgtttacagctgcgccgtgaggcattggggggccgaggggccc60t．AgtccagaggatgtgggagccggaagttccggagccgccttcggagagcagcgccacgctgB．gtccagaggatgtggga璺ccggaagttccggagccgccttcggagagcagcgccacgctg661A．tggtgcgcggtgggattggcggtgggcatcgcggggatcgcggcggggaccgccctcattB．tggtgcgcggtgggattggcggtgggcatcgcggggatcgcggcggggaccgccctcatt721A．ctgcgcgccgtgcgccgcaacgccgccaaccgccaaccggggctgctctg8B．ctgcgcgccgtgcgccgcaacgccgccaaccgccaaccggggctgctctga图4-6不同来源鸡。链基因核苷酸序列比较A摘自GenBank(登录号：AY357254)；B．本实验所克隆鸡Ⅱ链基因的测序结果Figuts4-6Comparisonofthenucieicao；dsequenceofchickenogenefr∞differentsourcesAQuotedfromGenBank(accessionnumberAY357254)：BNucleicacidsequenceofdchaingeneclonedbythisstudy注：图中带下划线的核苷酸为不同来源鸡n基凼之间的区别。1．A．EMAVLSGAAVPLLLLGVLGGVGAVLKPHVLBEMAVLSGAAVPLLLLGVLGGVGAVLKPHVL61．A．VELDAAOTVWRLPEFGRFASFEAQGALQNM32LQAEFYQRSEGPDKAWAQFGFHFDADELFHLQAEFYORSEGPDKAWAQFGFHFDADELFHAVGKQNLEVMIGNSNRSQQDFVTPELALFP B．VELDAAQTVWRLPEFGRFASFEAQGALQNMAVGKQNLEVMGNSNRSQQDFVTPELALFP121．A．AEAVSLEEPNVLICYADKFWPPVATMEWRRSGAWSEGVYDSVYYGRPDLLFRKFSYLPFB．AEAVSLEEPNVLlCYADKFWPPVATMEWRRNGAVVSEGVYDSVYYGRPDLLFRKFSYLPF181．A．VPORGDVYSCAVRHWGAEGPVORMWDPEVPEPPSESSATLWCAVGLAVGlAGIAAGTALIB．VPORGDVYSCAVRHWGAEGPVQRMWEPEVPEPPSESSATLWCAVGLAVGAGlAAGTALI241．A．LRAVRRNAANRQPGLLB．LRAVRRNAANRQPGLL图4—7不同来源鸡。分子氨基酸序列比较A．摘自GenBank(登录号：AY357254)：B本文作者所克隆鸡a基因测序后翻译的氨基酸序列Figure4-7Comparisonoftheamino-atidsequenceofchickennmolecuIefromdifferentsourcesA．QuotedfromGenBank(accessionnumberAY357254)；B．Amino～acidsequencetranslatedfromchickenogeneclonedinthiSstudy．注：图中带下划线的氨基酸为不同来源鸡a氨基酸序列之间的比较。1．A．gcagccatggB．gcagccatgg61A．ctgggagcccB．ctgggagccc121A．ggtgagtgccBgcagagtgcc181A．aaccggcagcB．aaccggcagc241A．ctgggtgagcB．ctgggtgagc301A．aatatagcggB．aatg_cagtgg361A．aggagcgtggB．aggagcgtgg421A．gaccgtctggB．gaccgtctgg481A．ctgaacgggcB．ctgaacgggc541A．tggacgtaccB．tggacgtacc601A．tgccgggtggB．tgccgggtgg661A．gacgcgggcaB．gacgcgggca721A．ctggcgctggB，otggcgctgg781A．ccagggatgcB．ccagggatgcggagcgggcgggccggccgcac七acct98aactacc￡gaaagtacgcgcaagttcatgcacgcaagctgagtcaggctgaacgggccctgata___qgt_ttctgagcccaaggtcgtgctacgtgggaggagacaggtgctggtagcacgccagggagcaagctggctcttcgttgaattagcgtcccggcgcggcacgcggcggcaccgagcttcgacagcatactggaaca旦!ctggaacccggcacaacgagggtctcggacgggcttcggagcgcgtgggtgctggagcctgcggcaggctgacgggcgttcctgcgcgcgggggccgccctcggcgtcgggtgaggtcggg曼gaggtgacgtggggaagcaacggcgagoaacg_ccgtacgggattctacggggttggcgctgcagttacccgccgggtgtccacgggtatccacggaccgtcccgccccatcagccgtggggggctatggggggctggtcagaaagtgctggtggctcttcttctatcttccagtgatctggacagttctggagagaatttgtggcaatacgtggcagcttctggaag旦ttctggatggagtccttgggagtccttcgggctccctagatcgaggtacgtgatgcaggcgcggggaaggcgtgggatcgtgctgggggcgccccgt图4-8不同来源鸡B链基因核苷酸序列比较actgctggcgcggtgcgatagacttttaaaggaaatctacg旦a垦atctaccgatacaccggaacctaatgggacgaaatgcacggtgcaggcccgaaaccgaagtggttcgaacggggaccagctacgtggcctccggcggcc弘cggcggctcgtcttccgccgccgct A．摘自GenBank(登录号：$66480)：B．本实验所克隆鸡B链基因的测序结果Figure4-8．CompariSONoftherlUClefcacidsequenceofchiokenBgenefromdifferentsourcesA．QuotedfromGenBank(accessionnumber$66480)：BNucleicacidsequenceofBchaingeneClonedbythisstudy注：图中带下划线的核苷酸为不同来源鸡B基因之间的区别1．61．121181241AAMGSGRVPANRQOFMHFDSNR00YAHFDSRSvEPKVRVSRSVEPKVRVSWTYOVLWLELALGLFVFLRAGAVLVALLALGARPAAGTRPSAFFQWTFKAECHYPNGTERARFLERHIYAGAVLVALLALGARPAAGTRPSAFFFYGAIGECHYLNGTERVRYLDREIYDVGKYVADTPLGERQAEWNSNAEILEDEMNAYDTFORHNYGVGESFTVQDVGKFVADTPLGEPQAEYWNSNGELLENLMNIADGPCRHNYGlLESFTVQALQSGSLPETDRLACYVTGFYPPEIEVKWFLNGREETERVVSTDVMQNGDALQSGSLPETDRLAOYVTGFYPPEIEVKWFLNGREETERVVSTDVMQNGDTVPRRGDSYVCRVEHASLRQPISQAWEPPADAGRSKLLTGMGGFVLGLVFTVPRRGDSYVCRVEHASLRQPISQAWEPPADAGRSKLLTGVGGFVLGLVFGOKGRPVAAAPGMLNGQKGRPVAAAPGMLN圈4-9不同来源鸡B分子氟基酸序列比较A．摘自GenBank(登录号：$66480)：B本文作者所克隆鸡B基因测序后翻译的氨基酸序列Figure4-9Comparisonofthesmino—acidsequenceofohickenBmoIOCUIefromdifferentsourcesA．QuotedfromGenBank(accessioanumber$66480)．B．Amino—acidsequencetranslatedfromchicken0geneclonedinthisstudy注：图中带下划线的氨基酸为不同来源鸡B氨基酸序列之间的比较。4．2GST．MItCII融合蛋白的提取与纯化4．2．1SDS—PAGE检测诱导表达的融合蛋白将外源DNA片段插入原核表达载体pOEX．4T一1中后转化到宿主菌BL21中，经IPTG诱导培养，可在宿主菌BL2I中表达出GST蛋白与外源蛋白的融台蛋白。GST蛋白的分子量约为26kDa，含有771个核苷酸的鸡MHCIIo推测其分子量约为26kDa，因此GST．Ⅱ融合蛋白的分子量理论上应约为52kDa。含有798个核菅酸的鸡MHCll0推测其分子量约为27kDa，因此GST—B融合蛋白的分子量理论上应约为53kDa。对照菌(PGEX．4T．1转化阳性的BL2I菌)和重组菌(pGEX-4T一1一a和DGEX．4T．1—8转化阳性的BL21菌)同时用IPTO进行诱导表达，SDS—PAGE结果显示，重组菌经IPTG诱导后与诱导前相比，分别在约52kDa处(图4-10泳道i)和在约53kDa处(图4—1l泳道4)各产生了一条较浓的新蛋白条带，与预期的融合蛋白GST—n和GST一0的大小相符，表明重组表达质粒pGEX-4T一1-a和pOEX一4T一1—9经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中成功表达出GST—Q和GST—B融合蛋白。而对照菌经IPTG诱导后与诱导前相比，出现一条新的约26kDa的蛋白表达条带(图4-10泳道2和图4．11泳道2)，表明pGEX．4T一1经IPTG诱导后表达出GST蛋白。34ABABABA8AB 图4—10表达产物的SDS-PAGE图谱。1未诱导的pGEX一4T一1；2．诱导的PGEX一4T一1；3．未诱导的pGEX一4T一1／o：4诱导的pGEX一4T一1／a；5．蛋白质标准分子量；Figure4-10SDS—PAGEmapofexpress}or1productsLane1UninducedpGEX一4T—I：Lane2．InducedpGEX一4T一1：Lane3．gMnducedpGEX一4T一1／aLane4．InducedpGEX一4T一1／Ⅱ：Lane5PrateinMWmarker图4-11表达产物的$DS—PAGE图谱。1．诱导的pGEX一4T一1／B；2诱导的pGEX-4T-1；3蛋白质标准分子量；4．未诱导的pGEX一4T一1／目5．未诱导的pGEX一4T一1FIgure4-11SDS—PAGEmapofexpressIonproductsLane1．InducedpGEX一4T一1／B：Lane2InducedpGEX一4T一1：Lane3．ProteinMWmarket：Lane4UninducedpGEX一4T一I／0：Lane5UninducedpGEX一4T—l4．2．2GST．MHCIl融合蛋白的可溶性鉴定将诱导后的重组菌悬浮于裂解缓冲液中，不同条件下破碎菌体，离心菌体裂解液，上清和沉淀分别进行10％SDS—PAGE，以鉴定GST-MHCII融合蛋白的可溶性。结果表明，GST．n目的蛋白出现在沉淀中(图4．12泳道2)，而上清中则无目的蛋白出现(图4．12泳道1)，表明GST．n融合蛋白是不溶性的，以包涵体的形式存在。同样的方法鉴定GST．B融合蛋白的可溶性。结果表明目的蛋白也以沉淀形式存在(图4—13泳道2)，而上清中则无舀的蛋白出现(图4-13泳道1)。实验结果表明GST—n和GST一0融合蛋白都是不溶性的，以包涵体的形式存在。 图4-l2GST—a融合蛋白的可溶性鉴定1．诱导的重组菌裂解上清；2．诱导的重组菌裂解沉淀：3．蛋白质标准分子量Figure4-12dentificationofGST’ofusionproteinSOIubiIityLane1．Supernatentofrecombinantofinducedculture；Lane2PelletofrecombinantofindueedcuItureLane3．Protein删marker图4-13Gs卜B融合蛋白的可溶性鉴定l诱导的细菌裂解t清液：2诱导的重组菌的裂解沉淀：3蛋白质标准分了萤FIgure4-13IdentifioationofGST—BfusianproteinsoIubiityLaneISupernatentofreeombinantofinducedcultm‘e；Lane2．Pel1etofrecombinantofinducedcultureLane3ProteinMWmarker4．3GST—MHCII融合蛋白的提取与纯化4_3．1pGEX．4T．1．MHCII诱导表达的条件优化4．3．1．1最佳IPTG浓度的确定静置培养过夜的含有pGEX．4T．1／a和pGEX。4T．1／B重组质粒的BL21细菌培养液，按1：100稀释，培养2～3h后分别加入IPTG至终浓度为0．4mmol／L、0．6mmol／L、0．8mrnol／L、1．0mmol／L、1．2mmol／L，分别进行SDS．PAGE检测，结果如图所示(图4—14和图4—15)。结果表明不加诱导剂IPTG作为对照时，在约52KD处和约53KD处都无目的蛋白条带出现，当IPTG的工作浓度逐渐增加时，pGEX一4T．1／q和pGEX．4T—l／B融合蛋白的表达量呈缓慢增加趋势，pGEX一4T一1．d当IPTG浓度为1．0mmol／L时蛋白表达量最高，此后融合蛋白的表达量呈下降趋势，而pGEX-4T—l／36 B当IPTG浓度为1．Ommol／L时蛋白表达量最高。故我们把pGEX．4T—l／。和pGEX一4T-I／0最佳IPTG浓度都选定在1．0mmol几。圈4—14．不同fPIG浓度pGEX一4T-1／a的表达1．蛋白质标准分子量；6．未诱导的pGEX一4T一1／a：2--5泳道分别为IPTG浓度在06、08、10、1．2mmol／LpGEX一4T一1／n的表达Figure4-14Theexpressi011ofpGEX一4T一1／datdifferentooncentrationofIPTGbvSDS—PAGELanel-ProteinMⅣ01ai’ker；Lane2～5TheexpressivelevelofpGEX一4T一1／awithIPTGconcentrationat0．6、08、1．0、1．2mlol／L：6UninducedpGEX一4T～i／a图4—15不同IPIG浓度pGEX-4T-1／B的表达l米诱导的PGEX一4T-1／B：2蛋白质标准分于量；3～6．泳道分别为tPTG浓度在0．6、08、10、1．2mmol／LpGEX一4T—I／B的表达Figure4—15，TheexpressiOr)ofpGEX'4T一1／岿atdifferentCODcaDtga-t；0／3ofJPIGbySDS-pAGELane1．UnindueedpGEX一4T一1／13：Lane2．ProteinMwmarker：Lane3--6，TheexpressivelevelofpGEX一4T一1／BwithIPTGconcentrationat06、0．8、I．0、12mmol／l，4f3．1．2最佳诱导时间的确定为了确定最佳诱导表达时间，分别在IPTlG诱导前和诱导后2h、3h、4h、5h、6h各取样ImL，进行SDS—PAGE检测。结果(见图4．16和图4—17)表明，pGEX．4T．1载体中的鸡。和B基因在大肠杆菌BL21中的融合表达是一个很快的过程，IPTG诱导2h后重组蛋白就有较高的表达，随时间的递增，表达量也随之逐渐增加，但增加的幅度不是很明显。4h后表达水平基本稳定，不再上升，故把最佳诱导时间选定在 4h。图4-16不同诱导时间pGEX一4T／o的表达1．蛋白质标准分予量；2～5．泳道分别为熏组菌诱导2、3、4、5h的细菌裂解液：6．重组菌束诱导的细菌裂解液Figure4-16Theexpressionofp6EX一4T一1／aatdifferentjnductiontimebySDS-PA6EariaIvsisLanelProteinMwmarker=Lane2～5．Inducedfor2、3、4、5hrespectively；Lane6pGEX-4T一1／auninduced图4-17不同诱导时间pGEX-4T／13的表达1～4泳道分别为重组菌诱导2、3、4、5h的细菌裂解液；5．重组菌未诱导的细菌裂解澉；6蚩白质标准分了量Figure4-17TheexpressionofpGEX一4T一1／BatdifferentinductiontimebySOS—PA6EariaIysi8Lanel～4．Inducedfor2、3、4、5hrespectivery；Lane5．uninducedpGEX一4T一1／e；Lane6．ProteinMWmarker：4．3．2GST．MHCI!融合蛋白的大量提取结果收集诱导表达4h的细菌，反复冻融和超声方法裂解诱导菌，离心裂解液所得沉淀即为包涵体，用包涵体洗涤液洗涤2～3次得到纯化的包涵体。加入十二烷基肌氨酸钠溶解纯化的包涵体，超声使包涵体迸一步溶解。用PBS透析溶解后的包涵体(GST．n蛋白：见图4．18和GST．B蛋白：见图4-19)以除去其中的去污剂十二烷基肌氨酸钠，并使蛋白复性。诱导菌裂解液和蛋白复性样品分别进行SDS．PAGE电泳检测，结果显示，与诱导菌裂解液中的蛋白质(图4—18泳道2和图4-19泳道3)相比，提取到的包涵体经洗涤后GST．a蛋白(图4一18泳道1)和GST—B融合蛋白(图4—19泳道2)的含量在总蛋白中所占的比例大大提高，杂蛋白大大减少，表明提取到的包涵体经洗涤后得到一定程度的纯化。 图4-18GsT—d包涵体的SDS-PA(]E电泳分析1．溶解后的GST—a包涵体蛋白：2．诱导后细菌裂解液；3．诱导前细菌裂解液；4．蛋白质标准分子量Figut'e4-18SDS—PAGEaRalysisofGST一0iticIUSionbodies1Solubilizationofinclusionbodies；2．Inducedculture；3．UninducedCUlture：4ProteinMWmarker图4-19GsT—B包涵体的SDS—PAGE电泳分析1蛋白质标准分子量；2溶解后的GST一13包涵体蛋白：3诱导后细菌裂解液；4诱导前细菌裂解液Figure4-19SDS—PAGEanaIysisofGsT—BitiCIusionbodieS1．ProteiinMWmarker：2．S01ubilizationofinclUSionbodles，3．InducedcultuIe．4．Uninducedculture4-3．3GST．MIICII融合蛋白的纯化结果由于上述实验所得的GST．a和GST．p融合蛋白可能需进一步用于一些纯度要求较高的实验(如做为抗原包被ELISA板和单抗的制备等)，因此必须进行纯化处理。本实验随后将透析后的GST．a和GST．B融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖珠进行亲和层析纯化，得到纯度更高的GST．a(图4．20泳道3、4)和GST一0蛋白(图4—21泳道1、2)。对于图示条带中出现的浓度较低、分子量较小的非特异蛋白条带，估计是GST-o和GST．D融合蛋白的降解产物。 图4—20纯化的融合蛋白GST—Q的SDS-PAGEl～2．超声溶解的包涵体；3～4纯化的融合蛋白GST—o；5．蛋白质标准分子量Figure4-20GST。aproteinputif；GationbySDS—PAGEl～2．Solubilizationofinclusionbodiesbysonieation；3～4PurifiedGST／oprotein5ProteinMWmarker图4+21纯化的融合蛋白GST一且的SDS—PAGE1～2．纯化的GST-B融合蛋白；3～4．超声溶解的包涵体j5，蛋白质标准分了量Figure4-21theGST—BproteinputifioatjonbySDS—PAGEl～2．PurifiedGST一0protein：3～4．Solubilizationofinclusionbodiesbysonicetion；5ProteinMWmarker4．3。4GST．MHCII融合蛋白的浓度测定Folin．酚法对融合蛋白GST．q和GST．0的定量实验表明：诱导菌经裂解、离心、包涵体洗涤液洗涤、十二烷肌基氨酸钠溶解、透析后所得到的GST—o和GST-13融合蛋白经Folin．酚检测，根据标准曲线计算GST-n融合蛋白浓度约为1．5mg／mL左右，GST．13融合蛋白浓度约为2，0mg／mL左右，浓度较大。透析后的融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖珠亲和层析柱纯化后经Folin．酚检测，据标准曲线计算蛋白浓度约为O．5mg／mL和O．8mg／mL，与纯化前相比浓度有所降低。 0．90．80．70．60．5040．3020．100003x+0．17540100020003000标准蛋白的浓度(ug／mL)●标准曲线■alphaprotein^betaproteinf一线性(标准曲线)’幽4—22标准崔自(BSA)曲线厦其方程式Figure4—22TheGurveandequatioRofstandardprotein(BSA)4．4鼠抗鸡MHCII多克隆抗体的鉴定结果经琼脂免疫扩散实验测定，结果表明鼠抗鸡a血清的有效稀释度为1：16，13血清有效稀释度为1：32。间接ELISA法确定抗原的最佳包被量，结果表明，GST．a和GST．B抗原包被量为1099／mL时，包被效果最好，因此在用间接ELISA法检测鼠多抗的效价时，GST．o和GST—B抗原的包被量为每孔10pg／mL。接着用间接ELISA法检测鼠多抗的效价，结果表明，抗体的有效稀释度都可达1：64000(见表4．1和表4-2)。表4—1鼠抗鸡d抗体的ELISA检测结果TabIe3-1ELISAassayrosuItofmiceagainstchiokenaantibody表4-2鼠抗鸡B抗体的ELISA检测结果TabIe3-2EL『SAassayresuItofmiceagainstchickenBantibody4 5讨论5．1鸡脾细胞中总RNA的提取及mRNA的反转录5．1．1总RNA的提取5．1．1．1控制RNA酶的活性Rnase是生物活性非常稳定的酶，它耐热、耐酸、耐碱．活性不依赖任何辅酶，pH值耐受范围宽。外源的Rnase主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂，而内源性的Rnase来源予样品的组织细胞。由于RNA酶来源广泛，且难以使用常规的诸如高压等方法来消除，提取的总RNA易被RNA酶所污染或被RNA酶降解，所以如何防止RNA酶污染是本实验的关键一步。通常使用方法就是将实验中所有离心管和玻璃器皿先用洗清洁剂清洗，然后用流水冲净，再用O．5MNaOH溶液浸泡10分钟，再用流水反复地冲刷洗净，最后用0．1％的DEPC溶液室温下浸泡24小时，第二天再用蒸馏水洗3～5遍，所有的玻璃器皿依据常规方法洗净烘干后，180。C下烤干8小时。这并不意味绝对避免了RNA酶污染，因此在实验过程中尽量采用操作步骤较为简单的方法，以减少总RNA的暴露时间，降低RNA酶污染的机会。5．1．1．2提取RNA的注意事项所用的酚要单独配制、单独使用；使用的水均要事先用DEPC处理并高压消毒；操作过程中尽量避免酚、氯仿等有机相或其他它杂质带入样品：RNA避免过分干燥、冻干或真空抽干：离心收集RNA沉淀时，离心机的转速不超过12，0009，以保证所制RNA充分溶解。为防止RNA降解，应将之少量分装保存，以避免反复多次冻融。5．1．1．3RNA的来源我们知道MHCIIa和B链主要表达在B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞中，而鸡的脾脏中含有丰富的B淋巴细胞，因此本实验主要从鸡的脾脏中提取MHCII12和B链基因。对哺乳动物和禽类的大量研究表明，淋巴细胞只有在有丝分裂原的刺激下才高效表达。PHA和ConA是较为常用的两种丝裂原，且不同动物淋巴细胞其使用浓度不一。对于鸡淋巴细胞的诱导，PHA和ConA都曾有学者使用过，并做过对比研究。Ceruti等【6l】研究表明，相同浓度的PHA和ConA诱导淋巴细胞，ConA在很短的时间内就可以刺激产生大量IL-2，而PHA则需要一个相对较长的时间。Stuart等[62]研究表明高剂量的PHA(2099／m1)；'j‘能刺激淋巴细胞产生IL．2：而低剂量的ConAf5,g／m])束U激淋巴细胞24小时就可诱导淋巴细胞大量表达。本实验中使用ConA，其浓度为5p_g／ml。我们设立几个培养时间段，分别为6小时、12小时、18小时和24小时。实验结果表明18小时表达量最好。在鸡的脾细胞培养中，一定量的犊牛血清是必须的，本实验在培养液中加入5％的犊牛血清，在培养过42 程中取得了较为满意的结果。5．1．1．4RNA的检测RNA纯度和完整性对基因克隆的影响也很大，对RNA的检测手段也是影响RNA提取成功的关键。不同实验室采取不同的提取与检测方法，有的采用常规的琼脂糖电泳就可以观察到28S，18s，5S电泳带，有的采用甲醛变性琼脂糖电泳，具体何种方法视实验室条件和具体实验而定。本实验采用常规的琼脂糖电泳就可以观察到RNA典型的28S，18S，5s三条带电泳带。提取的RNA样品中，mRNA的量很少，一般只占1～5％，80～85％的RNA为rRNA，还有10～15％的tRNA和核内小分子RNA。欲以总RNA作为模板逆转录扩增特异的目的基因片段用于RT．PCR扩增目的基因片段是一种易于成功的策略。对于RT．PCR来说，细胞中最少的是mRNA真含量一般足以用来扩增，只有当提取总RNA不合适时才直接分离mRNA[63】。5．1．2逆转录反应RNA二级结构的存在影响了cDNA的合成。在进行反转录反应之前，先将RNA70。C力N热10min之后骤冷，以破坏RNA的二级结构，同时提高反转录反应温度亦可克服RNA二级结构的影响。本研究选用的反转录酶为从禽反转录病毒颗粒纯化得到的禽源反转录酶，反应最适温度为42。C，其有利于反转录反应中的cDNA的合成。反转录反应结束后，70。C5min，使RNA—DNA解体，而且净化了反应体系。RT—PCR扩增体系中，cDNA合成可用Oligo(dT)特异性反义引物来引导。Oligo(dT)日I物可与哺乳动物mRNA的内源poly(A)+尾相结合，作为一种通用引物能用于常规的cDNA第一链的合成。实验以，营,RNA作为模板，直接用Oligo(dT)作为引物合成cDNA第一链，省去mRNA分离步骤，节省了时间，保证了特异。眭-cDNA产物的出现[64】。5．2MHCIIa和13链基因的获得5．21引物设计的合理性在利用RT．PCR扩增MHCIIn和13链基因时，引物设计是否合理，直接影响到PCR扩增目的基因的效率。合理的引物设计是高效扩增的基础，否则，目的基因扩增效率低下，甚至PCR失败。引物设计是应遵循以下原则：f1)，引物长度以15～30bp为宜，过长则使最适延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74。C)，不能保证产物的特异性，过短也会降低反应的特异性；(2)引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3，端不应超过8个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发；(31．引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构。这种二级 结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合；(4)．两引物之间不应有互补性，尤应避免3’端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性；(5)．G+C含量一般为40％～60％。有效引物的Tm为55～80。C，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳，两个引物的Tm值能相接近；(6)．引物的延伸是从3’端开始的，不能进行任何修饰。3’端也不能有形成任何二级结构可能，引物3’端不能发生错配：(7)．引物的5’端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。为了方便目的基因操作，设计引物时，在上游和下游引物的5’端分别引入和质粒载体相同的两个不同的内切酶位点和保护碱基，确保目的基因阅读框和方向的正确性，而添加保护碱基的目的，是因为大多数限制性内切酶的有效切割要求在它们的识别序列的5’端有2～3个非特异性的额外碱基，而提高内切酶的近末端的切割效率。5．2．2关于G+C％含量引物中G+C的含量一般为40％～60％。但本实验中，Q和B链引物中的G+c％含量分别高达71．4％和80．9％，因此运用常规PCR扩增体系难以获得特异性产物。故在PCR扩增体系中添加了甘油和二甲基亚砜(DMSO)，有效地提高了扩增特异性和产量，(多弱带变成一条明亮的带)。同时也降低了退火温度(a的从723℃下降到67。C，13的从74．3℃下降到67。C)。实验证明，添加适当的甘油(5％～10％)和DMSO(2％～10％)可极大地提高富含G+C片段的扩增特异性165，”J。据报道对于大片段DNA的扩增也是有效的。此外，添加0．5～2．Omol／L甜菜碱(5mol／L储存液)也是有效的。甘油和二甲基亚砜(DMSO)能提高G+C含量的DNA片段的特异性扩增，与它们的性质和功能有关。其中甘油表现为：1．提高聚合酶的热稳定性，如Taq聚合酶在95～97。C时，在甘油存在下，稳定性可提高两倍多；2．能有效地降低熔点和解链温度(每10％的甘油可降低2．5～3．0"C)。这有助于变性模板和增大引物退火的特异性。DMSO表现在：1．功能性降低熔点和解链温度(每10％的DMSO可降低5．5～6．0℃)：2．加速链的重新复性，提高DNA抗有害物质和抗链断裂的热稳定性作用。5．3重组载体的构建5．3．1载体的类型及载体的选择质粒载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成的，并设置了多克隆位点，即存在多个单一的内切酶位点，便于外源DNA的插入。按其功能分有克隆载体和表达载体。克隆载体又叫复制型载体，含有复制子、筛选标记、多克隆位点等，能在宿主细胞大量复制，得到多拷 贝目的基因片段，并含有测序所需的通用引物，可以方便进行测序。～般来说，在选择与外源DNA连接的载体时，应注意：I)．凡尽可能选择松弛型：2)．尽可能选择与外源DNA有相同的内切酶位点，以便外源DNA能以粘性末端与载体连接；3)’连接产生的新质粒，能被一定的限制性内切酶切割而不切割外源DNA片段，以便重新回收插入的外源DNA片段：4)．不影响对构建在载体上的基因的转录、翻译起作用的密码结构：5)．尽可能采用定向连接，以免为以后的鉴定带来麻烦；6)．尽量避免载体自连：a．采用不同的内切酶位点可以避免载体自连．b．采用单一的酶切位点对载体和目的片段进行连接时，尽量降低载体和目的片段在连接体系中的比例，同时降低载体和目的片段之间的比例，可减少自连，以确保获得少量的单菌落，便于鉴定出理想的重组子。本实验所用克隆载体为pGEX．4T一1载体，可以使外源基因在大肠杆菌中快速复制并被直接测序。5．3．2重组载体的连接方式及影响因素在重组载体构建中，外源片段与载体连接有几种方式：l粘端连接，2平端连接，也可分为单酶切粘末端非定向克隆和双酶切粘性末端定向克隆。单酶切粘末端非定向克隆虽然效率很高，但存在两种连接可能，即一个正向连接，一个反向连接，所以连接后的鉴定较为麻烦。定向克隆技术是最佳的重组方案，即用两种不同的能产生粘性末端的限制性内切酶，同时切割外源DNA片段和载体DNA，使载体DNA酶解后产生的末端与外源DNA片段的粘性末段完全匹配，在T4DNA连接酶作用下实现重组，在重组载体中原连接处的酶切位点仍可保留。本实验采用双酶切粘性末端定向克隆技术。在实验过程中发现影响连接、转化成功率的一个重要因素就是连接反应过程中外源DNA与线状质粒DNA的比率及线状质粒DNA的浓度，通常按下列公式：插入DNAfng)=3X载体DNA(ng)X插入DNA(bp)／载体DNA(：bp)。实验中通过比较发现外源DNA与线状质粒DNA以3：1的摩尔比连接效果最好。载体酶切完全、线性化好时，得到阳性重组子的比例也较高。另外，感受态细胞活性大小也是影响重组载体转化效率的重要因素。制备过程中应注意：11．菌液OD值应达到O．3～O．4之间，细菌处于对数生长期：2)玮0备过程中应使菌液处于低温环境(4℃)；3)．整个实验注意无菌操作。感受态细胞最好是做完后接着就用，此时其状态最好。冻存最好在超低温或液氮，这样再次用效果还可以。但是时间不能太长，一般不能超过72小时，否则细胞的活性大大降低。本实验采用 CacL2一MgcL2法制备大肠杆菌BL21感受态细胞，实验证实转化效果良好，可见转化时所采用的感受态细胞活性大小对提高转化效率非常重要。5．3．3重组质粒筛选在基因克隆工作中，重组质粒的鉴定是一个工作量较大的步骤。不同的克隆载体及相应的宿主系统，其阳性重组质粒的筛选方法不同。总的可以分为两类，即针对遗传表型改变筛选法和分析重组质粒的结构特征的筛选法。前者如抗菌素筛选法(蓝自斑筛选和插入失活)1671和营养缺陷的互补选择法，后者如快速裂解菌落比较重组DNA的大小，限制性内切酶切鉴定和杂交法、菌落原位杂交、PCR筛选法及表位筛选法。其实这四种方法是相辅相成的，在具体操作中常常是几种方法交替进行。本实验中就是先采用了抗菌素筛选法筛选阳性克隆，然后用限制性内切酶切鉴定法进一步确证pGEX一4T，I／MHCIIⅡ和pGEX．4T．1／MHCIIB是否已经重组。所用克隆载体pGEX．4T-I含有Amp基因，而其宿主细胞BL21不含有Amp基因，无Amp抗性。外源的鸡MHCIIo和B基因插入载体的位点在抗药性基因之外，不会导致抗药性基因的插入失活，且仍能编码抗药性基因，因此含有重组质粒的转化细胞，能够在含有Amp的琼脂平板上生长成菌落。除阳性重组质粒以外，自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组质粒也均能在含有Amp的LB平板上长出菌落。抗生素法只能初步筛选阳性克隆，随后对初步筛选出的阳性克隆菌落小量培养，提取质粒，并用相应内切酶进行双酶切鉴定，若有与预期大小相等基因片段被切下，可进一步证明扩增得基因片段已J下确插入到载体中。构建原核表达重组载体还有一个关键的步骤，就是一定要确保插入基因的正确翻译读码框架(OR_F)，使目的基因以正确的密码子进行转录和翻译【6⋯。因为本实验采用了不同的双酶切体系，所以最大可能性地避免了载体自连。5．4DNA序列测定根据密码子的简并性原则，碱基突变并不改变在相应部位的氨基酸，进而不会影响蛋白质的性质。测序后，与己知序列进行比较，发现a链仅有4个核苷酸有突变，而氨基酸仅有2个发生改变。B链的序列比较发现，42个核苷酸发生改变而导致27个氨基酸发生改变。这种DNA碱基的改变可能有以下原因：(1)来自不同品系的鸡种的cDNA模板可以影响PCR产物；(2)PCR扩增过程导致DNA碱基的改变，可能与所用的Taq酶特性有关，因后者所催化的DNA复制、聚合过程有一定的错配率。氨基酸的序列同源性分别达99％：N95％。具有如此高度的网源性，我们确认已经克隆到了鸡的a和B链同源分子。我们成功地克隆出鸡的n和B链后，为进一步在原核表达系统中进行表达、研究其重组产品的免疫学和生物学活性奠定了基础。 5．5d和B基因在大肠杆菌BL21中的诱导表达5．5．1表达系统的选择本研究的目的是为了制备安全、经济、高效具有生物学活性的鸡的MHCII。和B，并表达为相应的蛋白质，这不仅要求表达载体具有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作，而且还要求容易导入载体并能够进行高密度表达培养。故选择合适的载体是目的基因得以表达的关键。基因工程表达小分子蛋白有多种系统，常用的有真核表达系统如哺乳动物表达系统和昆虫细胞表达系统等，原核表达系统如E．coli表达系统，酵母表达系统等。真核表达系统对宿主细胞和表达载体的要求较高，要求宿主细胞具有装配、糖基化及分泌的能力，要求载体具有完整的真核转录单位，有选择性基因标记等等，真核表达系统所面临的最大问题是表达效率低，且操作复杂、成本高，且尚有许多内在机制尚未弄清。酵母表达系统具有无可匹敌的高表达特性，对真核基因表达产物具有一定的加工能力，遗传背景清楚，培养工艺简单，被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。不过酵母的转译后修饰与高等生物存在差异，如过度糖基化，这会改变其抗原性。所以人们仍然用较简便的原核表达系统来表达基因工程蛋白。原核表达载体要求有一个强的启动子及其两侧的调控序列：要有SD序列；SD序列与起始密码子之间要有合适的距离：在克隆基因与启动子之间要有J下确的阅读框架；外源基因下游加入不依赖p因子的转录终止予区【6”。其特点体现在原核生物繁殖快，无核膜，转录和翻译连续进行，因而具有快速、高效、成本低廉等优点。目前对其研究得比较清楚，表达产物可达到相当高的水平，外源蛋白的表达产量可占细菌蛋白总量的5％～30％，甚至高达40％。因此本实验表达的是原核细胞表达系统。5，5．2大肠杆菌(E．co们表达外源蛋白的特点在原核表达系统中，常选用大肠杆菌(E．colO作为基因工程表达宿主，其优点是遗传背景清楚、细胞生长快、容易培养、转化效率高、周期短、安全性好、成本低，并且易于操作，可进行高密度培养和适合表达不同基因产物等特点17⋯，是许多外源基因表达系统中最好的一种，大量有价值的基因产物在大肠杆菌中获得了表达。而且表达蛋白可大量生产，又易于纯化，还能诱发机体的抗体反应，加之人们己对其基因结构及表达调控原理有了较多的了解，所以广泛地被人们采用。本课题选用的表达体系是大肠杆菌表达体系，宿主细胞为目前最常用的基因工程菌．大肠杆菌E．coliBL21菌株。5．5．3关于表达载体pGEX-4T一1本实验所用的的质粒pGEX一4T．1为含谷胱甘肽S．转移酶(GST)的融合表达载体，是AmershamPhamacia公司产品，该载体的组成成分与其他表达载体相似，含有启动子(tac)、lac操纵基因、SD序列、lac阻遏蛋白基因等⋯J。 我们选用该载体是基于以下特点：(1)．tac启动子受乳糖操纵子控制，GST的强启动子保证了在IPTG诱导下GST融合蛋白的高效转录及表达；(2)．启动子下游为GST基因，GST与多克隆位点间存在凝血酶(thrombin)识别点，鸡MHCIIa和B基因片段以正确的阅读框架克隆至多克隆位点上，在IPTG的诱导下能表达GST和MHCIIQ和8的融合蛋白。该融合蛋白的GST部分，能与谷胱甘肽的琼脂糖珠可逆结合，在凝血酶的作用下又可被去除，因此便于纯化【72】：(3)．载体内含有lac阻遏蛋白基因，使目的基因可控性表达即可诱导表达，提高了表达效率；(4)．pGEX．4T．1还含有用于原核表达系统筛选的遗传标记，即氨苄青霉素抗性基因(Amp‘)，可以使转化了重组质粒的大肠杆菌获得对氨苄青霉素的抗性，便于筛选：(5)．在外源蛋白以包涵体形式表达时，GST—MHCIIn和B融合蛋白与Glutahionesepharose4B珠的的亲合结合是判断经溶解及复性后融合蛋白是否具有正确的空间构象即完全复性的重要生物学特征，确保下一步检测MHCIIq和13的免疫学和生物学活性。5．5．4载体表达的外源蛋白表达条件的优化5．5．4．1影响目的蛋白诱导表达的因素诱导表达使细菌的生长和外源基因的表达分开，克服了外源基因在细菌中高效表达对宿主的生长和代谢的影响，也克服了细胞代谢的损伤对外源基因的表达的影响。诱导表达条件的摸索对提高蛋白表达量至关重要。外源基因诱导表达常用的有几种方法，时间诱导和药物诱导以及温度诱导等"”。主要目的是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷，即在诱导表达实验中，应使细菌处于对数生长期再进行诱导，可使表达蛋白的产率增高。本实验所采用的原核表达载体是IPTG诱导型的，载体为GST融合蛋白表达载体pGEX．4T—l。该载体的启动子为人工构建的强启动子tac。tac是由lac启动子和trp启动子杂合人工构建的启动子，具有lac启动子和t巾启动子的优点。lac启动子来自在大肠杆菌的乳糖操纵子。它由启动基因、分解物基因活化蛋I刍(CAP)结合位点、操纵基因的部分D一半乳糖苷酶基因组成，受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控是通过CAP因子和环一磷酸腺苷(cAMP)激活启动子，促使转录。负调控是调节基因产生阻遏蛋白结合因子在操纵基因上，阻止转录。但如果有乳糖的存在，乳糖与阻遏蛋白结合而解除了对转录的阻遏。异丙基p—D一硫代半乳糖(IPTG)是p一半乳糖苷酶的底物类似物，lac启动子有很强的诱导力，原因是它能和阻遏蛋白结合，使操纵基因呈游离状态，用lac启动子构建的表达系统在原核细胞中表达时，IPTG可提高比48 真核基因表达水平50倍。5．542a和B基因的诱导表达大肠杆菌系统在表达外源蛋白时，蛋白表达量的大小受到诸多因素影响，如表达载体、宿主细胞、表达条件(诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG的浓度等)等。本研究主要对原核表达条件进行了优化，以使融合蛋白得到最佳表达。一般说来，外源基因的表达量是随着IPTG浓度升高而升高的，但诱导剂同时对宿主菌也会产生一定的毒害，因此采用什么样的tPTG浓度诱导很关键。多采用IPTG浓度范围为O．025mmol／L～lmmol／L来测试。将诱导时间定为446小时，分别加入终浓度为0mmol／L、O．1mmol／L、0．2mmol／L、0,4mmol／L、O．8mmol／L、1．0mmol／L、1．2mmol／L等的IPTG浓度进行梯度诱导。在稀释菌液同样倍数的情况下做诱导，通过SDS—PAGE电泳结果，对上述表达出的蛋白进行初步的分析，通过初步鉴定，我们得出Q在1．0mmol／L时表达量最大，而B也是在1．0mmol／L时表达量最大，所以我们确定a和口的IPTG为1．0mmol／L为最佳浓度。本实验采用在37℃诱导生长条件下，1．0mmol／L(Q)和1．0mmol／L(0)IPTG诱导浓度，分别诱导1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时等，SDS—PAGE电泳结果分析确定了4小时为最佳诱导时间。诱导4小时。和B基因的诱导表达蛋白的表达量最高，图3，17和3．18中泳道的蛋白带在位于蛋白分子量为62．2kDa和43．0kDa之间，分别都有一条新增的蛋白条带，与预测的目的蛋白大小相符。pGEX一4T-l为融合载体，所表达出的蛋白是融合蛋白，除了自身的大小26kDa外，同时也表达了菌体的一部分蛋白，其大小分别为25kDa(a)和26kDa(D)，因此目的的蛋白质大小应为52kDa和53kDa。从诱导时间来看，当诱导4个小时时，表达量最大；诱导5小时后，表达量没有变化，推测可能是菌体培养过长，Amp逐渐失活、菌体老化、死亡、分解等因素而导致表达量下降，而诱导1、2小时时表达量较少。说明诱导时间在4小时可以获得n和13基因的诱导表达的融合蛋白的最佳表达量。这提示，在进行。和p基因原核蛋白质表达时，B,寸fBJ选在4小时即可，此时的表达量最大。本实验采用IPTG诱导，表达量较高，在探索诱导时间和诱导物浓度对蛋白质表达量的影响时发现，并不是诱导时间越长，蛋白质表达量越多，也不是诱导物浓度越大蛋白质表达量越多。本实验得出结论a和13的IPTG终浓度为1．0mmol／L，诱导表达都在4小时时，蛋白表达量最大。通过对IPTG的使用浓度和诱导时间进行系统探索，可以充分地为以后研究提供实验依据，节省IPTG的使用量，缩短诱导时间。其中诱导物IPTG本身有毒性，并不是理想的诱导物，而且价格也很昂贵。但从目前的研究来看，还没有找到更为理想的诱导物，凡是用药物诱导法诱导表达目的蛋白均用IPTG诱导。实验研究表明，在实验室条件下小量表达目的蛋白质用IPTG诱导还是比较方便的。 5．6目标蛋白的分离、复性及纯化5．6．1关于包涵体尽管大肠杆菌表达体系有很多优点，但是基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成。包涵体是细菌表达的蛋白质在肽链折叠过程中，部分折叠的中间态之间的特异性错误聚合，在胞内互相凝集而形成的无活性的固体颗粒。包涵体主要含有重组蛋白和一些菌体杂质，其中包括RNA聚合酶、细菌膜蛋白、rRNA和质粒DNA等[80i。包涵体的形成，可使在胞内表达的外源蛋白不易被细菌的蛋白酶所降解，同时也有利于重组蛋白的分离纯化【74’巧J。但是包涵体内的蛋白是杂乱无章地错误折叠，因而也是没有活性的。许多学者尝试以可溶的非包涵体形式，如周质分泌表达和外分泌形式(excretion)来表达外源蛋白。但是，这种策略的最大弱点就是表达量极低。已有大量的研究表明，鸡细胞表达的蛋白大多为糖基化蛋白。虽然原核表达系统不能有效地将表达产物进行糖基化，但用该系统表达的重组鸡细胞分子同样具有类似于对应天然蛋白的生物学活性，说明糖基化对细胞因子生物学活性的影响不大[76,77]。因此，我们仍然选择了目前较为成熟的、以包涵体形式高效表达外源蛋白的策略。包涵体形成后，表达蛋白不具有物理活性、不能用凝胶层析柱进行纯化，必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性(使形成包涵体的表达蛋白恢复其活性的过程称为包涵体蛋白复性)。5．6．2融合蛋白包涵体的获得因为包涵体主要存在于细菌中，因此如何处理细菌是获得包涵体的重要一步，并且细胞裂解必须很充分，以防止细菌碎片与目的蛋白共沉淀。通常是将细菌进行裂解，释放出包涵体。但是裂解细菌要注意力度，因为裂解不完全将影响到包涵体的获得率和纯度，而裂解过度可能会破坏目的蛋白活性。裂解细菌的方法有多种，诸如机械法(超声处理、高压匀浆、撞击研磨)；物理渗透法(反复冻融、渗透压冲击)；化学法(融菌酶处理、脱氧胆酸法、酸碱处理、表面活性剂SDS和Triton一100等、鳌含剂EDTA等或有机溶剂)等【聊。采取何种方法主要取决于实验研究的条件，与蛋白质的本身性质关系不大[79】，关键是在整个实验过程中要求快速和确保低温(≤4℃)。本次实验中表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。在实验中。我们采取了反复冻融后超声波裂解细菌的方法。反复冻融作用较温和，对蛋白造成破坏小，而超声处理操作简便、液体量损失少，同时可对染色体DNA进行剪切，大大降低了液体的黏度，有利于后续的目标产物的分离。但超声处理时，需要间歇进行，以防连续的超声使溶液温度升高和强度过高而造成对蛋白结构的破坏。溶菌酶可以溶解细菌细胞膜，利于细菌的裂解。所有操作应在冰浴中进行。本实验中采取两种方法裂解细菌，相比其它方法来说，快速、经济，效果相当。 菌液裂解后，目标蛋白将释放于溶液中，溶酶体中的蛋白水解酶同时也释放出来，这将可能造成对目标蛋白的降解。为了防止目标蛋白被降解，反复冻融和超声裂解细菌时，常在溶液里添加蛋白酶抑制剂，本实验添加的蛋白酶抑制剂为PMSF。5．6．3融合蛋白包涵体的洗涤和溶解包涵体中除了目的蛋白外，还含有宿主菌蛋白质、核酸、脂质以及糖类等杂质[8m，虽然这些杂质在复性时不会影响折叠的速率，但其中的一些物质却会显著影响聚集反应的速率，从而影响总的复性速率。因此，包涵体在纯化前一般不能直接用来进行复性，必须将其中的杂质在溶解和复性前降至最低水平[79,81,82]。包涵体洗涤液通常用去污剂如Triton)(-100、脱氧胆酸钠(DOC)、蔗糖和尿素等缓冲液配制，以除去其中大部分的外膜蛋白、脂质、核酸杂质等m84]。离心细菌裂解液可获得包涵体，经包涵体洗涤液的洗涤则得到纯化的包涵体。从包涵体中纯化表达蛋白的一个优点是包涵体易于与细胞其它成分分离。一般的水溶液很难溶解包涵体，只有在变性剂存在的条件下才能很好的溶解。针对不同的用途选择不同的溶解包涵体的方法，包涵体溶解常用的试剂有尿素、SDS、十二烷基肌氨酸钠等，尿素、SDS会使蛋白质变性，并且不易复性，失去与谷胱甘肽琼脂糖珠结合的能力，且尿素对动物有毒性，不能用尿素处理的蛋白来免疫动物，而十二烷基肌氨酸钠对包涵体的溶解作用温和，不会使GST变性，且效果较好16⋯。十二烷基肌氨酸钠还能够抑制融合蛋白与细菌的膜蛋白组分的共聚集，减少与谷胱甘肽琼脂糖的非特异性吸附。蛋白溶液中的十二烷基肌氨酸钠可通过透析除去金属离子。我们所得的融合蛋白包涵体用来免疫动物制备多克隆抗体，因此我们选用十二烷基肌氨酸钠作为变性剂来处理本实验的蛋白质包涵体。5．6．4融合蛋白的复性及影响因素分子内二硫键正确形成是蛋白质复性的关键18”。纯化后的重组蛋白在复性前一般都先溶于变性剂，并加入少量的还原剂，如B一巯基乙醇、DTT等，来于丁开分子内可能错配的二硫键，使其成为变性的还原态蛋白质，然后经过体外复性后爿+能成为可溶的具有生物活性的蛋白质。虽然包涵体是表达蛋白非天然形式的混合物，但是其肽链本身是完整的，或者溅一级结构是正确的。溶解的包涵体蛋白获得完全变性，即除一级结构和共价键保留外，所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露。然后在一定的条件下除去变性剂促使产物蛋白完成正确的蛋白折叠过程，获得天然结构。但蛋白复性的过程比较复杂，所采用的方法也不同。变性剂去除速率在折叠中间物的积累和蛋白质聚集中起着重要作用，大多数研究通过分步稀释或透析缓慢去除变性剂来提高复性率。目前采用的方法主要有两种：一种是稀释溶液，使溶液中变性剂浓度逐渐降低，蛋白开始复性。此法简单易行，但操作的液体量体积有时过大，同时也降低了蛋白质的浓度：另一种是 透析、超滤或电渗析除去变性剂。透析法常用于实验室，溶液对水或缓冲液透析，变性剂透过膜扩散浓度逐渐降低，蛋白质获得复性，该法液体量总体积和蛋白质浓度变动不大，但时间较长，有时会形成蛋白质沉淀。鉴于实验室条件，因此本实验中使用了透析的方法。为促进二硫键的正确折叠，在复性之初使用一些试剂如二硫苏糖醇、B一巯基乙醇等打开二硫键。变性蛋白在复性时的一个普遍现象是不可逆聚合物的形成。由于不可逆聚合物的形成，复性蛋白的收率一般都较低，通常包涵体蛋白复性率很低，不超过20％，通过本实验我们也发现，复性的效率较低，造成蛋白表达产物的损失，因此如何改进包涵体蛋白的复性方法亦将是实验研究所面临的重要内容。复性过程中的一些条件，如蛋白浓度、杂质含量、pH、重折叠速率、温度和离子强度等均会影响复性的收率18“。蛋白质的纯度是影响复性效果的重要因素，由于杂蛋白与重组蛋白一起复性时可形成杂交分子而聚集，因此复性时要求目的蛋白具有一定的纯度。蛋白质的质量浓度对复性也有重要影响，高浓度利于中间物的聚集，故复性时蛋白质量浓度要低，但浓度过低又给后处理带来不便，因此复性时蛋白质量浓度一般调整到10一v100mg／Lts”。整个系统中，所有的缓冲液pH值相对于重组目的蛋白等电点均为碱性，必须在7．0以上，以防止质子化作用影响『F确配对的二硫键的形成，同时避免pH的变化引起目的蛋白的变性和溶解性降低等。因此，通常复性液的pH控制在可使蛋白复性的最大值，适宜的pH一般在8．0～9．0嗤“。本实验中，复性液pH采用8．0，避免了pH的变化过大而引起蛋白质的聚集和蛋白质长时间处于碱性条件下(包涵体溶解液的pH一般为9．O～10．0)。5．6．5融合蛋白的亲和层析纯化如何提纯和分离利用基因工程表达的蛋白质，是关键的问题。利用亲和层析的方法对表达的蛋白质进行纯化，目的是去除一些杂质蛋白。本实验利用谷胱苷肽琼脂糖凝胶亲和层析柱对表达的蛋白质进行纯化。纯化的效果与谷胱苷肽琼脂糖凝胶亲和层析柱质量、目的蛋白的提取方法、实验条件等因素有关系。有研究表明，GST融合蛋白的包涵体如果能够溶解在1％Triton一100、1％Tween．20、10mmol／LDTT或者O．03％SDS中，融合蛋白可以通过亲和层析得到很好的纯化结果，因为这些条件并不破坏GST与glutathione琼脂糖珠的结合。如果不能溶解在上述试剂里，需要按常规方法提取包涵体，复性后再进行亲和层析¨”。本实验中，MHCIIa和B链表达重组蛋白不溶于l％Triton·100¨⋯、1％Tween-20、10mmoI／LD1vr或者0．03％SDSqb，因此只能按常规方法变性溶解包涵体，复性后再进行亲和层析。到目前为止，研究报道从包涵体中亲和层析得到纯度较高和产量较高的目的蛋白不多，影响产量和纯度的另外一个因素可能是洗脱效率不高。此外还与重组蛋白实际复性率偏低也有一定关系。一般重组蛋白复性率不超过20％，所以复性后的 蛋白溶液中能与glutathione琼脂糖珠结合的蛋白量就很低。本实验采用Batch法对GST／MHCIIa和B重组蛋白进行纯化，并试图通过改变复性后重组蛋白与91utathione琼脂糖珠结合的时间，来提高蛋白的结合率。结果不是很理想，SDS．PAGE电泳用洗脱缓冲液从杂质蛋白中洗脱下来的目的蛋白，出现一条很弱的非目的蛋白带，可能于洗脱过程中蛋白降解有关。但是纯化出的蛋白完全可以满足后续常规实验需要，如ELISA实验，多抗的制备，免疫荧光染色实验等等。5．6．6融合蛋白的测定蛋白质含量测定主要有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定如OD280光吸收法；另一类是利用化学方法测定蛋白质的含量，如Bradford检测法、Folin．酚试剂法(Lowry检测法)、二哇琳甲酸(BcA)检测法等。这两类方法备有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求及实验室条件选择。目前实验室多用Folin一酚试剂法测定蛋白质含量。此法的优点是操作简单，迅速，不需要特殊仪器设备，灵敏度高。较紫外吸收法灵敏度10～20倍。反应在约15rain内就有最大显色，并至少可稳定几小时。在测试时应同时做空白实验消除干扰因素对反应数值的影响。本实验通过测定，其中的。蛋白含量达到1．5mg／ml，B蛋白含量达到2．0mg／ml，足以满足后续免疫动物、制各抗体的实验需要。5．7抗体制备5．7．1抗体制备的分类及影晌条件抗原和抗体是免疫学实验的两大重要因素，也是整个免疫反应的基本条件。目前抗体有单克隆和多克隆两大类。单克隆抗体用杂交瘤技术制备，多克隆抗体存在于免疫动物抗血清中。前者生产成本高、周期长，实验技术要求高，故本研究选择制备多克隆抗体。制备高效价、高特异性的免疫血清必须有理想的免疫原、挑选适宜的动物和制定确实可行的免疫方案，才能达预期的目的。蛋白质是良好的抗原，本实验制备的。和B融合蛋白已经亲和层析法纯化，可作为免疫原免疫动物，制备抗血清。多克隆抗体的制备常受以下的因素的影响：1)．动物种类如果需要取得可与尽可能多的潜在抗原表位起反应的抗血清，则应选择在系统进化上与作为靶蛋白来源的动物完全不同的种系为宣；2)．遗传因素选用远交品系远优于近交品系，后者可能对某些特定抗原缺乏强有力的应答能力；3)．抗原的物理状态部分变性的蛋白质有助于提高其免疫原性，彻底变性的蛋白质(如长时间煮沸、还原或烷基化的蛋白质)诱导的抗血清专一地或优先地与变性蛋白反应。 4)．佐剂如果抗原量成为制约免疫反应的因素，添加佐剂有助于改善免疫应答，它可以通过避免抗原的降解而延长其半寿期。此外，佐剂可以极度降低抗原的毒副作用，并可使抗原在免疫部位缓慢、持续释放从而提高巨噬细胞对抗原的吞噬能力。5．7．2免疫剂量和免疫途径选择合适的动物进行免疫极为重要，鼠做为制备多抗的免疫动物，容易生产出效价高的多抗，但所得量较少。而家兔做为实验动物生产多抗，虽然获得抗体的量较多，但效价不高。根据本实验得需求，选用普通小白鼠作为免疫动物来制备相应的多抗。免疫原合适剂量的选择应考虑抗原性强弱、分子量大小，动物大小和免疫时间。小动物抗原剂量(以蛋白抗原为准)为50～200pg／只，因而我们选择100pg／只融合蛋白剂量作为每次注射的剂量。一般情况下免疫途径以皮内免疫最佳，皮下免疫次之，腹腔注射和静脉注射效果差。口服易诱导免疫耐受。增强免疫一般并不需要与初次免疫同样的免疫途径。本实验初次免疫采用腹腔注射，增强免疫采用背部皮内多点注射。增强免疫的间隔和次数依赖于初次免疫后动物的反应情况，间隔时间如果太长则易于抑制免疫反应的强度，如果在初次免疫后3～6周内给予增强免疫则会提高血清抗体的滴度p∞。抗体滴度一般在免疫后1～2周开始出现，同时需要经常给予增强免疫以产生和维持高滴度的抗体水平。本实验每隔3周增强免疫一次，增加二次，在末次免疫后10天取血，收集血清，经琼扩和ELISA检测抗体效价证实所产生的抗体滴度已达实验要求。 6结论6l本实验采用RT—PCR方法在国内较早成功地从鸡脾细胞中克隆到编码鸡MHCIIn和0链的cDNA的基因，经酶切鉴定和核酸序列测定得到证实。6．2通过原核表达成功表达了鸡MHCIIa和B链融合蛋白，并用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行纯化，获得了纯化的GST．MHCIId和GST—MHCIIB融合蛋白。6．3利用纯化的GST．MHCIIa和GST．MHCIIB融合蛋白作为免疫原，免疫小鼠制备了鼠源抗鸡。和8多克隆抗体。琼脂扩散实验和ELISA实验表明，抗体与纯化的重组GST．MHCIIn和GST-MHCIIB蛋白具有良好的反应性，并有较高的效价，可满足实验的要求。所有这些为进一步研究鸡a和B基因提供了重要的实验材料和依据。 参考文献[11孙东晓。中国反刍家畜MHC基因多态性及序列分析[J]。中国农业大学学报，1999，22(6)：307~310【2]AuffrayC，LillieJW,Strominger儿，etalStructureandexpressionofHLA．DQalphaand—DXalphagenes：interallelicaltematesplicingoftheHLA·DOalphageneandfunctionalsplicingoftheHLA-DQalphageneusingaretroviralvector[J]．Immunogenetics，1987，26(1．2)：63～73[3]RovereP，ForquetF’ZimmermannVS，eta1．DendriticcellsfrommicelackingtheinvariantchainexpresshighlevelsofmembraneMHCclass11moleculesinvivo【J】AdvExpMedBiol，1997，417：195-201[4]SvenssonM，StockingerB，WickMJ．Bonemarrow-deriveddendriticcellsCaRprocessbacteriaforMHC-IandMHC-11presentationtoTcells【J】Jlmmunol，1997，l58(9)：4229-4236[5】llkovitchD，Ostrand-RosenbergS．MHCclass1IandCDS0tumorcell．basedvaccinesarepotentactivatorsoftype1CD4+Tlymphocytesprovidedtheydonotcoexpressinvariantchain[J】．CancerImmunollmmunother,2004，53(6)：525-532【6]6BrilesWE，McgiddonWH．OnmultipleallelesaffectingcellularantigensinthechickenfJ】，Science，1950，36：663-669[7】SchiemanL，NorclssogA．Relationshipofbloodtypeofhisco∞mpatibilityinchickensfJ】Science，1961．134：1008～1011【8]BrilesWE，BumstedN．NomenclatuveforchickenmajorhistocomPatibility(B)complex【J】lmmunogenetics，1982，19：441～445[9]9HalaK，ChausseAM．AttempttodetectrecombinationbetweenB—FandB-Lgenewithinthechic—kenBcomplexserologicaltyinginvitroMLRandRFLPSanalysis[J】Immunogenetfcs，1988，28：433-435[10]PlachyJ，PinkJRL，HalaK．BiologyofthechickenMHC[J]．CriticalReviewsinImmunology1992：12，47～79[11]XuYX，PitcovskiJ，PetersonL，eta1．Isolationandcharacterizationofthreeclass11MHCgenomicclonesfromthechicken【J1．JImmun01．1989，142(6)：2122～2132[12]SimonsenM，CroneM，Kochc，P，aLTheMHChaplotypesofthechicken[J】．Immunogenetics，1982，16(6)：5134532[13】MorganJJr,LillehojS，KlineK，eta1．CharacterizationanddevelopmentalexpressionofthechickenB-Gheterodimer[J】．DevCompImmunol，1990Fall；14(4)：425—437[14]SalmosenJ,DunonD，SkjodtK．Chickenmajorhjstocompat-bilitycomplexendodedB-Gantigensarefoundonmanycelltypesthatareimportantfortheimmunesystem【J]．AcadamicScienc。 e．1991，88：1359～1361[15】Satomonsen，J，Skjoet，K．Thechickenerythrocyte·specificMHCantigenCharacterizationandpurificationoftheB-Gantigenbymonoclonalantibodiers[J】lmmunogenetics．1987，75：373～381【16】SalomonsenJ，MarstonD，AvilaD，etalThepropertiesofthesinglechickenMHCclassicalclass11alphachain(B—LA)geneindicateanancientoriginfortheDR／E—likeisotypeofclasslImolecules[J]Immunogenetics，2003，55(9)：605—614[17】OdyC，CorbelC，DunonD，eta1．MHCclasslIbeta-chainandalphallbbeta3integrinareexpressedonT-cellprogenitorsinembryonicbonemarrow[J】MolImmunol，200I，38(I)：45～53[18】BourletY，BeharG，GuillemotF，eta1．Isolationofchickenmajorhistocompafm⋯tycomplexclassII(B-L)betachainsequences：comparisonwithmammalianbetachainsandexpressioninlymphoidorgan【J】EMBOJ，1988，7(4)：1031～1039[19】Aulrray,C，Strominger,JLhMoleculargeneticofthehumanmajorhistocompabiIitycomplexinAdvancesinHumangenetics，1986，Vol，15【20】Figueroa，F．&Klein，J．TheevolutionofMHCclass1genes[J】ImmunolToday,1986，7：78～83f21]Jlevn，TakahataN．PhyogenyoftheMHCcomplex[J】lmmunogicalReview,1990，113：0105～2896【22]JacobJP,MilneS，BeckS，ela1．Class11beta—chain(B—LB)geneflankthePapasingeneintheB·F／B-Lregionofthechickenmajorhistocompatibili【ycomplex[J】．Immunogenetlcs，2000．51(2)：138—147[23】FrangoulisB，ParkI,GuillemotF,eta1．IdentificationoftheTapassingeneinthechickenmajorhistocompabil时complex[J]．Immunogenetics，1999，49(4)：328～337[24】CuiJ，SorerL，CloudSS，eta1．Patternsofgeneexpressioninthedevelopingchickthymus[JlDevDyn．2004，229(3)：480～488【25]ToddpharG，HuttH，BaconLela1．Identificationcomplexpolymorphismspredictedtobeimportantinpeptideantigenpresentation[J1．PoultryScience，1993，72：1312～1317[26]SungAM，NordskogAW,LamontSJ，eta1．IsolationandcharacterizationofcDNAclonesforchickenmajorhistocompatibilitycomplexclass11molecules[J]．AnimGenet．1993，24(4)：227～233[27】KikkawaEF,TsudaTT,NaruseTK，ela1．AnalysisofthesequencevariationsintheMhcDRBl‘likegeneoftheendangeredHumboldtpenguin(Spheniscushumboldti)[J]Immunogenetics，2005，57(1·2)：99～107[28]LamontSJ．Thechickenmajorhistocompatibilitycomplexanddisease[J1．RevSciTech，1998，17(1)：128—142[291ZhouH．LamontSJ．ChickenMHCclassIandIIgeneeffectsonantibodyresponsekineticsinadultchickens【J】．1mmunogenetics，2003，55(3)：133～140[301DietertR．Intruduction：themajorhistocompatibilitycomplexasacommunicationgendcomplex57 (J1．PoultryScience，1987，66：774—775【311Maccubirf&Schierraan．CytotoxicreactivitytoreticuloendotheliosesvirustransformedcellsisMHC—restrictedinthechicken[JlProc，1983，42：439～444[32】Vainion，O，Veromaa，T．Racteliffe，MelalAntigen—Presentingcell·TcellinteractioninthechickenisMHCclass11antigenrestricted[J]．Immunol，1988，140：2864～2876[33]KaracsonyiC，KnottR，FulbierA，etal，Associationofmajorhistocompatibilitycomplex11withcholesterol-andsphingolipid·richmembranesprecedespeptideloading[J]BlotChem，2004，279，33：818～826[34]VainioO，KochC，ToivanenAB—Lantigen(classII)ofthechickenmajorhistocompatib¨nycomplexcontrolT·Bcellinteraction[J]．Immunogenetics，1984，19：13l～145[35】DunningtonEA，LarsenCT,SiegelPBela1．AntibodyresponsestocombinationsofantigensinwhiteLeghomchickensofdifferentbackgroundgenomesandmajorhistocompatibilitycomplexgenotypes[J]．oultSci，1992，71(11)：180t～1806[36】YonashN，HellerED，CahanerAeta1．DetectionofRFLPmarkersassociatedwithantibodyresponseinmeat-typechickens：haplotype／genotype，single-band，andmultibandanalysesofRFLPinthemajorhistocompatibilitycomplex[J]．Hered，2000，91(1)：24‘30[37】HaeriM，ReadLR，SharifSe1日f．IdentificationofpeptidesassociatedwithchickenmajorhistocompatibilitycomplexclassIImoleculesofB21andB19haplotypes【J1．1mmunogenetics，2005，56(11)：854～859[38】KariukiNjengaMEndothelialMHCclassIIantigenexpressionandendarteritlsassociatedwithMareklsdiseasevirusinfectioninchickens【J】．VetPathol，1995，32(4)：403,-41I[39】PevznerIY,KujdychI，DanglerCA，etalImmuneresponseanddiseaseresistanceinchickens11Marek’sdiseaseandimmuneresponsetoGAT【J】．PoultSci，1981，60(5)：927-932【401BrilesRW,TaffsRE，StoneHA．ResistancetoamalignantlymphomainchickensismappedtosubregionofmajorhistocompatIbiIIty(B)complex[J]Science，1983，219(4587)：977～979【41]HaeriM，ReadLR，SharifS，ela1．Identificationofpeptidesassociatedwithchickenmajorhistocompat．bilitycomplexclassIImoleculesofB2IandB19haplotypes[J]lmmunogenetics．2005，5601)：854-859[42】WeigendS，MashesS，LamontSJ，eta1．ResistancetoMarek’sdiseasevirusinWhiteLeghornchickens：effectsofavianteukosisvirusinfectiongenotype，reciprocalmating，andmajorhistocompat．bilitycomplex[J]．PoultSci，2001，80(8)：1064～1072[431Bacon，L．D，Witter，RL，MonaJB-haphlotypeinfluenceonMarek'sdisease，Roussarcoma，andlymphoidleukosisvirus，inductedtumorsinchicken【J1．PoultySci，1981，60：1132～1143[441ClareRA，StroutRG，BrilesWE，eta1．Majorhistocompatibility(B)complexeffectsonacquired58 immunitytocecalcoccidiosis[J]．Immunogenetics，1985，22(6)：593～599[45】MedarovaZ，BrilesWE．Resistance，susceptibility,andtocecalcomplexandalloantigensystem[J]PouhSci，2003，82(7)：1113-1117[46】LamentSJ，BolinC，ChevilleN．Geneticresistancetofowlcholerahistocompatibilitycomplex[J]Immunogenetics，1987，25(5)：284—289coccidiosis：effectsofBSlinkedtothemajor[47]DavisonTETheimmunologists’debttothechicken【J】BrPoultSci，2003，44(1)：6～21[48]Collins，WM．，Briles．TheBlocusOvIHc)inthechicken：associationwiththefateofRSV．inducedtumors【J】，Immnogenetics，1977，5：333—339(49]Nordskog，AMetal．InfluenceofBlocusbloodgroupsOiladultmortalityandeggproductionintheWhiteLeghomchicken【J]．Genetic，1973，75：181～189【50】BaconLD．Influenceofthemajorhistocompatibilitycomplexondiseaseresistanceandproductivity[J】．PoultryScience，1987，66：802～811[51]欧阳建华，袁立，孙权，等。中国泰和乌骨鸡MHC与其繁殖性能相关的研究fJl。江西农业大学学报，2000，22(1)：98～101【52]YoshimuraY’OkamotoT'TamuratLocalisationofMHCclassII，lymphocytesandimmunoglobulinsintheoviductoflayingandmoultinghens【J】．BrPoultSci，1997，38(5)：590-596[53]TingJP,TrowsdaleJ．GeneticcontrolofMHCIIexpression【J】．Cell，2002，109：s21-s23【54]ZhangB，WangETheE5proteinofhumanpapillomavirustype16perturbsMHCclass11antigenmaturationinhumanforeskinkeratinocytestreatedwithinterfeongamm【J]．Virology,2003，310：】00～108[55]MozdzanowskaK，FurchnerM，ZharikovaD，ela1．RolesofCD4+T-Cell·Independentand—DependentAntibodyResponsesintheControlofInfluenzaVirusInfection：EvidenceforNoncognateCD4+T—CellActivities[J]．Virol，2005，79(10)：5943-5951．【56】C．W迪芬巴赫，G．S．德维克斯勒著，黄培堂，愈炜源，陈添源等译．PCR技术实验指南[M]．北京：科学出版社．2000[57】J萨姆布鲁克(美)著，黄培堂等译．分子克隆实验指南[岫第三版．．ILK：科学出版社．2002[58】Garroll，Laughon．InDNAcloning：apracticalapproach【J]．IRL．A．S．C，t987，3：89～11[59】FrangioniJr,NeelBG．Solubilizationandpurificationofenzymaticallyactiveglutathiones—transferase【J】．AnalBiochem，1991，192：262～267[60】MelaniaE．Mercado—Pimentel，NicoleC．eta1．AffinitypurificationofGSTfusionproteinsforimmunohistochemicalstudiesofgeneexpression【J】．Science，2002，26：260～265[61]CerrutisolaS，KristensenF，VandeveldeM．Interleukinl-and2-likeactivitiesinthedog[J]VetImmunolImmunopathol，1984，6：261~271【62】StuaaCH，ModianoJF'NowellPC．1mmunophysiologicalstudiesofinterleukin。2andcanine lymphocytes【J]VetImmune]Immunopatholy,1992．33：1～16[63]Cw迪芬巴赫，G．s．德维克斯勒．PCR技术实验指南[M]幂}学出版社．1999：74～761641SambrookJ，RussellDW．Molecularcloning：alaboratorymanual．3rded．ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001【65]Chengs，FocklerC，BarnesW,eta1．EffectiveamplificationoflongtargetsfromclomedinsertsandhumangenomicDNA[JlProcNatlAcadSci，USA，1994，91：5695～5699[66】KorgeBP,GenSQ，McbirdOW,eta1．Extentivesizepolymorphismofthehumankeratin10chainresidesintheC‘terminalV2subdomainduetovariablem＼numbersandsitesofglycine[J]．ProcNatlAcadSci，USA，1992，89：910～914[67]姜泊等主编．分子生物学常用实验方法[M]．第一版．人民军医出版社．1996年2月．[68】卢圣栋主编．现代分子生物学实验技术m]．第二版、北京：中国协和医科大学出版社．1999，378—379[69]SmithMHDandDwinJV．Translationalintitationoffstructuredmessengers：anotherrolefortheSiagle-Dalgamointeraction[J]MolBiol，1994，235：173-184[70】ltow，KnrosawaYDevelopmentofaprokaryticexpressionvectorthatexploitsdicitronicgeneorganizationnrn[J】Gene，1992，118：87—91[71]SmithD．BandJohnsonK．S．Single-steppurificationofpolypeptidesexpressedinE．coliasfusionswithglutathioneS-transterase[J】．Gene，】988，67：331～340[72】GuanKL，DixonJE．EukaryoticproteinsexpressedinEcoB：animprovedthrombincleageandpurificationprocedureoffusionproteinwithgluthioneS-transferase【J]．AnalBiochem，1991，192：262-267[73]WeichertMJ，DohertyDH，BestEA，eta1．OptimizationofheterologousproteinreductioninEcell[J]．Cun—Opin13ioteclwol，】996，7(5)：494～499[74]MarstonFA，HartleyDL．Solubilizationofproteinaggregates[J1．MethodsEnzymol，1990，182：264-276【75]DerbyshireAstatkeM，JoyceCMRe—engineeringthepolymerasedomainofKlenowfragmentandevaluationofoverproductionandpurificationstrategies【JlNucleicAcidsRes，1993，21(23)：5439-5448【76】DigbyMR，LowenthalJW．Cloningandexpressionofthechickeninterferon—gammagene【J】InterferonCytokineRes，1995，1501)：939～945[77]SundickRS，Gill-DixonC．Aclonedchickenlymphokinehomologoustobothmammalian1L、2andIL-15『J1．1mmun01．1997，159(2)：720-725．[78】朱厚础译．蛋白质纯化与鉴定指南[M叫E京，科学出版社，2000：141～184f79]FischerB．Isolation，renaturationandformationofdisulfidebondsofeukaryoticproteinsexpressed in￡coliasinclusionbodies[J]．Biotechnolog)‘andBioengineering．1993，3f41)：98、106[801MarstonFA．Purificationofcalfprochymosin(pro-rennin)synthesizedin￡coli[J]Bio／Technology，1984，2：800[8IJ隋广超，胡美浩．大肠杆菌中包涵体的形成及其活性表达产物的分离[J】生物技术，1993，3(2)：6～9【82】MaachupalliRJ，KelleyBD，DeBemardezClarkE．EffectofinclusionbodycontaminantsOntheoxidativerenaturationofheneggwhitelysozyme[J]．BiotechnolPorg，1997，13(2)：144～l50[83]HlodanRCraigS，PainRH．Proteinfoldinganditsimplicationsfortheproductionofrecombinantproteins[J]BiotechGeneEngRev,1991，9：47—88[84]凌明圣，许详裕，丁树标以包涵体形式存在的重组蛋自的纯化和体外折叠[J]．中国生化药物杂志，1995，16(3)：135～139[85]WeinbergA，MeriganTcRecombinantinterleukin一2asanadjuvantforvaccineinducedprotection[J】．Immunol，1988，140：294-299[86]静国忠编著。基因工程及其分子生物学基础[M]。北京，北京人学山版社，1999：102[87】ZhaoQIrreversiblethermodynamictheoryforproteinfoldingandproteinthermo-dynamicstructures[J]．BiochemBiophys，200l，28：(3)429～435[88]SmithDB，andJohnsonKS．Single—steppurificationofpolypeptedesexpressedinEcoliasfusionswithglutethiones·transferase[J】Gene，1988，67：31-40[89]RudolphR，BohmG，lilleH．Foldingproteins．In：CreightonTEed．ProteinFunction：APracticalApproach，2nd[MJ．NewYork：IRL，1997，57～99【90]CooperPD，McCombC，SteeleEJ．TheadjuvanticityofAlgammulin，anewvaccineadjuvant[J】Vaccine，1991．9：408～4156 一汹渊汹搬删㈣淼抵捌溅删蝴』协汝黜鼎。称啦。榭‰躺础。砖‰黼始瓿：：：m*黜⋯。⋯蒜⋯⋯一黑⋯：一盛一a。+*撼一。c⋯=：“：一·’怒一、⋯c出；。一a，摄z—cc一嚣‰⋯t—i‰燃贼。态溅i怒娥酶鼢魄{越触}I＆嗽^&蜘巍榭斌轴静融熊贼憾8l溅‰⋯晦昂⋯一慧⋯一嚣⋯⋯t溉⋯“”潞⋯⋯c品⋯⋯”黑一uⅢ％努⋯⋯t潞。⋯⋯嚣m⋯“i黔一一删辘酝墓曦矾，哦觚≤涮崦哦攫婚热．帐咿趣‰。&舟咻。西洲晰{c!c氐胤抵蹦＼Z嚣蕊鸦赫瀑^赫^t_潞螂㈣#器⋯㈣黝州删4i如一≯“赫⋯⋯7舶⋯⋯∽毛⋯Ⅲf。i僦帆w融⋯⋯q蚺《蛀，雉沌撼^d、P如如办峨蛾麟△窭型．∑氐』k。，蕊心☆瑚张^8．棚、∞矾。蚶锨憾l邀燃酬㈣渊‰舭胁榭溅；}删螨娥‰栅船溅嫡，们～∞燃⋯÷⋯嚣Ⅲ赫。卷㈣dcn器·⋯⋯黔z-；⋯，点b⋯崩4赫一⋯：蔗⋯⋯”“i斡⋯⋯‘：强⋯⋯i矗⋯、。6《《16≮腾‰。脚翰《8J镰漱J怒触。＆洒囊《避嶙。弧氏‰《l瓜』‰晦。。心丸熊聃妒峙～出嘧产c。票6掣勰?黑⋯⋯r；蠹⋯⋯c；饕一⋯o；器加⋯：：；茹⋯⋯：；嚣t㈧⋯i矗⋯t”rj粕⋯⋯⋯⋯埘⋯’鲫⋯⋯“‘’嘛心肭胁慨哦‰留。怖施。，脚踏删脚协枞Ⅵ删龇醴^礤避心艘}{k蛰幽翊k叔箜邋‰叠嚏剑醯△趣涵业啦妞△避必幽垃幽心&。艇乜础q附录A鸡alpha基因测序彩图(BGH)Index．AThenucleotidesequencemappingofchickenalphagene 。j‰。“⋯嚣⋯⋯，?蠢⋯⋯e嚣％⋯⋯“臻⋯⋯a撮Ⅲ⋯一篇a⋯⋯；器⋯⋯一l蒜⋯⋯t：％⋯⋯；揣⋯㈣翩。删嘛桃删测h№批阿№幽脚蚓幽鼻一。，矗。溜勰￡⋯t器州⋯#。：蒜⋯。口”嚣‰⋯cq口?器椭^}t^}；器。{⋯口c?‰t，⋯4；品c洲々c口，0矗”⋯t口j嚣一⋯‘I删螋鳜剿螂溉删必蜷删蜒牌腆嬲。f绺恻蝌蜒幽鳖姗㈣型汹蚣翩煅‰函㈧㈧㈣㈧㈣㈤矧漱呱渊‰删‰蜥‰㈣斌‰赫黼蝴’⋯⋯⋯”⋯⋯⋯。"⋯89‘⋯⋯。。’⋯⋯⋯2‘⋯⋯。⋯⋯⋯M。。4⋯⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。臻觚删～《魏m抵翩黼‰，矾，肿砌‰觚蒿‰‰，山刊‰热∥哪。“‰如⋯焉％。e川⋯?嚣⋯⋯c蕊⋯⋯t嚣⋯⋯、?器cs。c⋯?要⋯⋯g《妊聃}t。cc爿；c，c⋯，甜；⋯⋯d如蹦ct⋯i器⋯⋯。㈣№蝴∞&op帆m利y№搬删㈣娃m州蚺—‰抓砌州协灯咿融是：⋯⋯i：k。；⋯0&⋯⋯·嚣：!⋯=；c?矗：。⋯一；潞⋯⋯-?戛⋯⋯c。巍一～tc；嚣一⋯c?器⋯一c嚣：’～⋯嚣：c卟以矾^．A州酬b艘饥，刑吣讯．m州1&烂、v—‰r找吣～。mh—u＼p嘶∥附录B鸡beta基因测序彩图(BGH)IndexB．Thenuc|eotidesequencemappingofchickenbetagene