鸡dazl基因克隆、原核表达和多克抗体制备

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1、鸡DAZL基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备摘要禽类原始生殖细胞(primodialgermcells，PGCs)是配子的前体细胞，可以作为将外源基因转入基因组和生殖系的有效载体，因为PGCs能够通过血流靶向进入杂合子胚胎性索，将遗传特性直接传递给后代。在体外培养条件下，超表达外源性DAZL的小鼠胚胎干细胞(MouseEmbryonicStemCells，mESCs)在不形成类胚体的情况下，诱导分化为有活力的精子和卵子；瞬时超表达DAZL的mESCs能抑制Nanog基因表达，但却能诱导生殖细胞核抗原表达；DAZL基因沉默导致Stella、Mvh、Prdm1等其它生殖细胞标志基因的

2、表达量下调。如果将DAZL基因与目的基因体内或体外共同导入PGCs，可能会提高这类细胞的生殖系传递能力，从而有助于解决转基因鸡效率低下的难题。1、从7日龄广西三黄鸡睾丸组织抽提总RNA，运用RT．PCR技术克隆了DAZL基因。实验结果表明：三黄鸡DAZL基因开放阅读框由870个核苷酸组成，其编码289个氨基酸；与GenBank中登记的鸡DAZL基因序列同源性达100％。2、生物信息学分析发现，三黄鸡DAZL基因核苷酸及氨基酸序列与其它有脊椎动物具有较高的同源性。鸡DAZL基因与人和牛的核苷酸序列同源性分别为73．5％和73．1％，氨基酸序列同源性则分别为71．5％和71．8％；氨

3、基酸序列多重比对发现，三黄鸡DAZL蛋白与部分已报道的脊椎动物同类蛋白具有保守的RRM结构域和DAZl重复基序，具有高度的进化保守性。DAZL蛋白系统发生树分析表明，鸡Dazl基因与其他物种间存在一定的遗传距离，虽与家鼠、牛和人类同聚为一枝，但之间亲缘关系相对较远。信号肽预测结果表明，鸡DAZL基因氨基酸序列的N端不存在信号肽。3、扩增的鸡DAZL基因亚克隆至原核表达载体pET30a上，成功构建了原核表达载体pET30a-DAZL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导His．DAZL融合蛋白表达，并通过SDS—PAGE和W．estemblotting加以验证。利用

4、Ni．NTAargrose介质纯化His．DAZL融合蛋白，并将其免疫新西兰大白兔，制各多克隆抗体，Westernblot检测其抗体的特异性。经SDS．PAGE分析表明，His．DAZL融合蛋白在大肠杆菌中得以高效表达，且以包涵体方式表达；应用8mol·L。1尿素溶解包涵体，利用镍离子金属螯合亲和层析法纯化，获得了高纯度His．DAZL融合蛋白；经WestemBloting检测，获得的鸡DAZL多克隆抗体能与His．DAZL融合蛋白特异性结合。结论：本研究成功克隆了鸡DAZL基因，通过原核表达得到了His．DAZL融合蛋白，进而获得了高特异性的兔抗DAZL多克隆抗体，为提高生殖系

5、传递能力的转基因鸡技术研究奠定了基础。体关键词：鸡DAZL基因分子克隆原核表达蛋白纯化多克隆抗IICloning，ProkaryoticexpressionofDAZLGeneandPreparationofPolyclonalAnti--DAZLAntibodyinChickenAbstractAvianprimordialgermcells(PGCs)areprecursorcellsofgametes．BecausePGCscouldmigratefrombloodintosexcordduringembryonicdevelopment，andtransmitparent

6、alineritedcharacteristicstooffsprings，theyareusedoftenasvectortotransferforeigngeneintogenomeandgermline．ThroughtheectopicofexpressionDeletedinAzoospermia-Like(Dazl)．independentofembryoidbodyformation，bothandoocytesmotiletailed-spennwereinducedbymouseES(mES)cellsinculture．Furtbennore．transien

7、tofDazlledtosuppressionofNanogbutknockdownnuclearantigeninmEScells．DazlinducedgermcellresultedinreductiongermcellmarkersincludingStellaintheexpression，MVHandPrdm1．IfDAZLandtargetgenearecombined，andtransfertochickenPGCs，itwillbepromisingthatge