Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表达【临床医学毕业论文设计】.doc

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1、临床医学论文-Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表达【关键词】肾炎【摘要】目的大鼠Hcymann肾炎（HN）是人类膜性肾病的经典动物模型，其发病机制的硏究推动了人们对膜性肾病的理解。Megalin是HN主要致病抗原，也是低密度脂蛋白受体家族成员，其胞外结构形成的4簇配体结合区域均可能存在抗原决定簇。本实验拟克隆其第2簇配体结合区域，并表迖融合蛋白，为进一步硏究其抗原决定簇的确切位置及其功能打下基础。方法采用RT-PCR获得大鼠肾目的片段Mcgalin基因3189-4169，再与原核表达质粒pTrcHisA结合构建重

2、组质粒，然后将重组质粒转入TOP10细菌诱导表达融合蛋白，最后用Western-Blot检测表达的融合蛋白。结果（1）RT-PCR获得的目的片段大小为lkb，测序证实为Megalin基因3189・4169;测序报告还显示有3个突变，分别位d2Megalin基因的3404、3647、37025其中前两个突变都不影响融合蛋白的氨基酸序列，第3个突变则将赖氨酸变成谷氨酸，经分析对融合蛋白表达无明显影响。（2）构建的重组质粒用BamHI和EcoRI双酶切后，得到预期的2个片段4.4kb和1kb，分别表示质粒pTrcHisA和Mega1in基因

3、3189-4169<>（3）用IPTG诱导TOPIO（含有重组质粒）融合蛋白表迖后，经Western-Blot检测发现了38kD的目的蛋白。阳性对照TOP/CAT在IPTG诱导前没有出现蛋白条带，在IPTG诱导后4h出现蛋白条带；阴性对照TOP10C不含有质粒）和TOP10（含有pTrcHisA）经IPTG诱导后均无目的条带出现。另外，融合蛋白的表达量在IPTG诱导后4〜6h增加明显。结论成功构建了重组表达质粒（带有Megalin基因3189-4169的pTrcHisA)；成功诱导了融合蛋白的表达，为进一步硏究Mcgalin基因抗原决

4、定簇的确切位置及硏究Megalin的功能提供了基础。【关键词】肾炎;基因;表位;融合蛋白[Abstract]ObjecliveRatHeymannnephritis(HN)isaclassicmodelofhumanmembranousnephropathy.Researchofitspathogenesishelpunderstandthehumanmembranousnephropathy•Mega1inisthemajorantigenofHN,anditisalsoamemberofthelowdensity1ipoprote

5、inreceptorgenefamily；itsextracellularregioncanbindmultipleligands,andthisextracellularregionformfourclustersofligand-bindingdomainscontainingpathogeniccpitopes.Sowcclonedthesecondclusterof1igandbindingrepeatsandexpresstherecombinantproteinscontainingN・Terminal6xHistags.

6、Thisstudywasaimedtoprovidethebasistopreciselylocatethepathogenicepitopeandhelpunderstanditsfundion.MethodsWeappliedreversetranscriptionPCRtoobtainobjcctivcband(Megalingene3189-4169),thenconstructedtherecombinantplasmidbyinsertingthisfragmentintopTrcHisA.Aftertherecombin

7、antplasmidwastransfectedintoTOPIO,theexpressionof6xHisfusionproteinwasinducedbyisopropylthio-/3-Dalactoside(TPTG).FinallyWesterBlotwasperformedtodelectthefusionprotein.ResultsRT-PCRshowedthesizeofobjectbandwsslkb.AfterrecombinantplasmidweredigestedwithBamHIandEcoRI,weob

8、tainedtwofragments:onesizewaslkb,theotherwas4.4kb.Western-Blotshowedthefusionproteinsizewas38kD‘andtheyieldoff