差异表达基因克隆技术的新进展 【临床医学毕业论文设计】.doc

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1、临床医学论文•差异表达基因克隆技术的新进展提耍分离并克隆差异表达基因是目前功能性基因硏究的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA、SSH、DSD、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Tnq酶出现及应用，这些技术将会不断完善与发展，具有广阔的应用前景。关键词差异表达基因；克隆现代分子生物学硏究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆

2、差异表达基因不仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断勻治疗提供重要的理论依据。近几年来，差异表达基因克隆技术不断完善与发展，已成为硏究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。一、mRNA差异•展刁•

3、[l]建立此技术时，5’端采用20条随机引物，每条由10个碱基组成，3「端采用12条引物即T12MN（M=A、C或G，N二A、G、C、T）。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列，差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在50%〜70%左右，差异条带在Northern印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994年Ito[2]等对3"端引物进行了改进，把12条引物改为3条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995年Ayala[3]等提出了在3「端锚定引物匀5「端随机弓I物上皆增加10个碱基，使得上下游引物Tm

4、値在60C左右，PCR循环参数也改为前5个循环采用LiangPardee推荐的参数，即94°C30s，40cC2min,72cC30s。经这样改进、显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同时使得差异条逼带的克隆十分方便°1996年4月，Liang和Pardee[4]对5’端此物进行了改进，引物条数改为8条，皆带上HindDI酶切位点，每条由13个碱基组成，3「端锚定引物采用3条，也带上Hindm酶切位点，每条由18个碱基组成，PCR循环条件仍采用94°C30s,40°C加in,72°C30s,40个循坏，最后在72°C延伸7min。1998年⑸我们在Liang

5、和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前5个循环采用94°C30s,40°C2min,72°C30s,后35个循环采用94°C30s,55°C2min,72°C30s，最后在72°C延伸7min。经这样改进，既保持了扩增效率，乂增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。总之，mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，但具冇较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列问题，虽然此技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。二、代表性差示分析代表性

6、差示分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是:靶方(Tester,T)和驱动方(Driver,D)的cDNA在进行差方式分析前均用一种识别4碱基序列的限制酚作切割处理，形成平均长度为256bp的cDNA片段代表群，第一次T与D杂交反应时，两者总量比为1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1:8000，再利用PCR以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，通过降低cDNA群体复

7、杂度和多次更换cDNA两端接头，来特异扩增日的基因片段。特别是T减D杂交反应后仅设置了72°C复性与延伸及95°C变性这两个循环参数哄20个循环，从而使PCR产物特异性大大提高。此技术最大的优势是差异条带在Northern日」迹上重现性好，假阳性少。缺点是所需起始材料较多，更多信赖于PCR技术，T与D之间若存在较多差异，或T中存在某些基因上调表迖，则难达到预期目的，而口工作量比DDRT-PCR大‘周期长。三、抑制性扣除杂交抑制性扣除杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)，是1996年Diatchenk［7］等提出

8、的--种新的克隆基因技术，其基本原理是