结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化

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1、结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化作者：高雪，薛莹，姜泓，柏银兰，师长宏，张海，李元，徐志凯【关键词】分枝杆菌　　【Abstract】AIM:ToobtainfurA(ferricuptakeregulatorA)genesegmentsofMycobacteriatuberculosis(MTB),expressefficientlyinE.coliandpurifythetargetproteins.METHODS:furAgenesegmentswereamplifiedbyPCRwithspecificprimersfromgenomeofMTBH37Rvstrai

2、n.Aftersequenced,furAgenesegmentswereinsertedintopRSETAandexpressedinE.coliBL21.Therecombinant(His)6fusedproteinswerepurifiedbyNiNTApurificationsystem.RESULTS:ThelengthofPCRproductwas453bp,identicalwiththatreportedbyGenbank.TheproteinswereexpressedinE.coliBL21assolubleproteins,accountingfor10％ofth

3、etotalbacterialproteins.SDSPAGEandWesternblotshowedthattheMrofthisgeneproductwas23.0×103.The(His)6fusedproteinswerepurifiedbyaffinitychromatography.CONCLUSION:furAofMTBwassuccessfullyclonedandexpressedinE.coliBL21.ThepurifiedproteinsareobtainedbyNiNTA9purificationsystem.Thisworklaysthefoundationfo

4、rfurtherstudyontheferricuptakeofFe2+inMTB.　　【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis;FurA;cloning;expression;purification　　【摘要】目的：获得结核分枝杆菌furA基因片段并高效表达、纯化.方法：用PCR技术从MTB毒株H37RvDNA中扩增出相应大小的DNA片段，将片段与pGEMTeasy载体连接后测序.将测序正确的furA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSETA，将连接产物转化入E.coliBL21，挑出阳性克隆，IPTG诱导表达重组的(His)6融合蛋

5、白.对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化.结果：PCR获得的furA序列与Genbank报道的一致(为453bp).重组载体在E.coliBL21中以可溶形式高效表达，融合蛋白经SDSPAGE和Westernblot分析，在Mr为23.0×103处有特异的蛋白条带，目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的10%，重组蛋白经镍柱进行纯化后，得到了高纯度的FurA融合蛋白.结论：成功克隆结核分枝杆菌furA基因片段，并在E.coliBL21中高效表达，亲和层析纯化后获得高纯度FurA融合蛋白.　　【关键词】分枝杆菌，结核；FurA；克隆；表达；纯化　　0引言　　铁是维持结核分枝杆菌(Mycobacterium

6、tuberculosis,MTB)新陈代谢所必需的营养物质之一，研究认为通过调节代谢途径来调控基因表达从而抑制MTB生长可以达到治疗结核病的目的［1］.9研究铁相关基因在MTB代谢过程中的作用，有助于我们深入了解MTB的致病机制，从而有效地控制结核病的流行.MTB中包括四种铁依赖的调节基因，它们编码的蛋白分属两个家族，分别为Fur和DtxR.其中Fur家族又包括FurA和FurB［2,3］.目前对于DtxR家族蛋白的结构和功能研究得比较清楚，而对Fur蛋白的研究比较少.我们从MTB中克隆furA基因片段，并在原核细胞中表达并纯化，为进一步探索其在MTB中的作用奠定基础.　　1材料和方法　　

7、1.1材料　　E.coliBL21,E.coliDH5α,MTBH37Rv菌株表达载体及pRSETA由本室保存.寡聚核苷酸引物由上海博亚生物技术有限公司合成；克隆质粒pGEMTeasy载体、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、各种限制性内切酶、连接酶及TaqDNA聚合酶均为美国Promega公司产品；IPTG为Sigma公司的产品；(His)6mAb购自第四军医大学免疫学教研室，HRP山羊抗小鼠IgG抗体购自华美生物公司