结核分枝杆菌rv2450基因的克隆、表达及纯化论文

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1、结核分枝杆菌Rv2450基因的克隆、表达及纯化论文薛莹，姜泓，高雪，柏银兰，师长宏，张海，徐志凯，李元【关键词】结核分枝杆菌【Abstract】AIM:ToobtainRv2450genesegmentsofMycobacteriumtuberculosis(Mtb),expressthemefficientlyinE.coliandpurifytheaimproteins.METHODS:Rv2450genesegmentsplifiedbyPCRersfromgenomeofMtbH37Rvstrain.Aftersequence

2、d,Rv2450genesegments.RESULTS:ThelengthofPCRproductsainlyexistedininclusionbodies.tb）Rv2450基因.freeltuberculosis,Mtb)RPF蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［1］.因此我们克隆表达并纯化Rv2450蛋白，以期进一步研究其免疫特性，评价其是否可作为候选结核亚单位疫苗的组分.1材料和方法1．1材料7H9液体培养基购自Difco公司；MtbH37Rv株为陕西省结核病防治研

3、究所惠赠；TaqDNA聚合酶，dNTPs，T4连接酶，HindⅢ，BamHⅠ及DNA电泳胶1回收试剂盒、pGEMTeasy质粒购自Promega公司；E.coliDH5α和pProEXHT质粒为本室保存；金属鳌合亲和层析介质（NiNTA）购自Qiagen公司.1．2方法MtbRv2450全基因序列的特异性引物序列为：P1：5′GCGGATCCAAGAACGCCCGTACGACG3′，含BamHⅠ酶切位点；P2：5′GCAAGCTTTGCGTCTTTTCGCGGTGG3′，含HindⅢ酶切位点和终止码.均由西安隆恩公司合成.取少量Mtb

4、H37Rv株接种于7H9液体培养基中，37℃培养2L液体培养物以9000g离心10min，将沉淀重悬于50μL裂解液（10×PCR缓冲液5μL，45g/L吐温205μL，45g/LNP405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL及水34.5μL）中，置于55℃水浴1h，95℃水浴10min使蛋白酶K灭活，再以9000g离心1min，取上清，用酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于20μL水中备用.以MtbH37Rv基因组为模板，以P1和P2为引物做PCR，经30个循环后，用PCR产物清洁试剂盒回收PCR产物.然后将其与pGEMTeasy载体按3∶

5、1的比例混合，用T4连接酶连接，转化用CaCl2低温制备的E.coliDH5α感受态细胞.然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg/L），以蓝白法随机筛选6个白色菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA.将提取的质粒DNA用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，37℃2h，进行10g/L的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子大小参照，观察有无约529bp大小的片段，然后随机挑取2个克隆进行测序.碱裂解法提取pGEMTeasy重组克隆质粒，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，经10g/L琼脂糖凝

6、胶电泳，回收目的基因条带，溶于20μL水中.取目的片段和同样用HindⅢ和BamHⅠ双酶切的pProEXHT质粒以1∶1的比例混合，用T4连接酶连接，转化用CaCl2低温制备的E.coliDH5α感受态细胞.然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg/L），37℃培养过夜.随机挑取6个菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养过夜.各取3mL碱裂解法提取质粒DNA，再以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定，挑选阳性克隆.将4个阳性克隆分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养18h，分别取50μL加到

7、5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养2~3h，IPTG诱导4h，进行120g/LSDSPAGE，并通过凝胶薄层扫描测定其表达量.将所构建的重组菌pProEXHT2450在选择LB培养液中37℃振荡培养18h，取50μL加到5mL选择LB培养液中37℃振荡培养2~3h，1mmolIPTG诱导4h，进行120g/LSDSPAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，用10g/LBSA封闭过夜，加抗组氨酸的特异性mAb作用1h，以10mmol/LPBS（pH7.2）洗涤后，加HRP标记的羊抗鼠IgG作用1h，以DAB显色观察表达产物.将制备

8、好的包涵体重悬于20mL缓冲液A中，室温搅拌2h，使包涵体完全溶解，10000g离心30min后，将上清液加入到用缓冲液A平衡过的NiNTAagarose柱上，然后分别用5倍柱床体积的缓冲液B，10倍柱床体积的缓冲液C，