结核分枝杆菌泛酸激酶的克隆表达及酶学性质论文

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1、结核分枝杆菌泛酸激酶的克隆表达及酶学性质论文张鹭，王庆忠，徐颖，陈嘉臻，路福平，王洪海【关键词】结核分支杆菌；,泛酸激酶；基因表达；酶类/分析Expression,purificationandenzymeactivitydeterminationofpantothenatekinasefromMycobacteriumtuberculosis【Abstract】AIM:ToobtainCoaA(pantothenatekinase)geneofMycobacteriumtuberculosis,expressefficientlyinE.coli,purifyt

2、hetargetproteinanddetectitsenzymeactivity.METHODS:CoaAgeneplifiedbyPCRersfromgenomeofMycobacteriumtuberculosisH37Rv,CoaAgenesegmentsmol/L).Therebinant(His)6fusionprotein.ThepurityoftherebinantCoaAinedbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC).CoaAMS).Theenzymeactivityetry.RESULTS:HPL

3、CshoshotuberculosisCoaAcontained39.3%αhelix,13.7%βsheet,14.3%βturn,and32.5%randomcoil.ThekiicparameterskcatandKmofMycobacteriumtuberculosisCoaAol/LforPantothenate,.freelol/LforATPrespectively.CONCLUSION:Thecloning,andexpressionofactiveMycobacteriumtuberculosisCoaAinE.colisystemsissucc

4、essful.TheseresultsprovidethemeansforfurtherstudiesonMycobacteriumtuberculosisCoaAasapotentialantituberculosisdrug.【Keytuberculosis;pantothenatekinase;geneexpression;enzymes/AN【摘要】目的：获得具有生物学活性的结核分枝杆菌（Mtb）重组泛酸激酶蛋白.方法：以结核分枝杆菌模式菌株H37Rv基因组为模板，扩增泛酸激酶基因CoaA(Rv1092c)，克隆入原核表达载体pET28a中.freelmo

5、l/LIPTG）下，收集细菌进行超声破碎，低温高速离心，得到的上清液经镍离子螯合型亲和层析柱纯化重组蛋白.高效液相色谱及质谱鉴定重组蛋白.采用酶联法测定重组蛋白的酶学性质.结果：得到了高表达、高纯度的重组结核分枝杆菌的泛酸激酶，酶催化过程中对泛酸的kcat和Km值分别为273.81kat/L,35.27μmol/L；对ATP的kcat和Km值分别为169.10kat/L,94.43μmol/L.重组蛋白经高效液相色谱及质谱鉴定，测得Mr约为39168.在5mmol/LTrisHCl缓冲液，pH值7.5，25℃条件下，重组CoaA的二级结构中有39.3%α螺旋，13

6、.7%β折叠，14.3%β转角，32.5%无规则卷曲.结论：成功克隆表达结核分枝杆菌泛酸激酶，酶学性质和二级结构鉴定表明重组泛酸激酶折叠正确，且具有生物学活性，为基于该酶筛选新型抗结核药物奠定了基础.【关键词】结核分支杆菌；泛酸激酶；基因表达；酶类/分析结核病是全球范围内病死率最高的传染病，寻找新的作用靶点，尤其是结核特有的、生理功能重要的蛋白质(主要是酶类)是开发新药物的重要途径［1-2］.泛酸激酶（pantothenatekinase，CoaA），真核生物中为PanK，是结核分枝杆菌进行辅酶A（coA）合成的关键性限速酶［3-4］，在能量代谢和细胞壁的生物合成

7、过程中至关重要［5-7］.截止目前，国内外有关结核分枝杆菌CoaA基因体外表达及相关功能的研究报道较少.我们克隆表达并纯化泛酸激酶蛋白，并探讨其生物学特性，为以该酶为作用靶点筛选新型抗结核药物的探索提供基础资料.1材料和方法1.1材料MtbH37Rv株为上海市肺科医院惠赠；E.coli，DH5α，BL21(DE3)，质粒pET28a均为复旦大学遗传工程国家重点实验室保存的菌株，培养于LuriaBertani（LB）培养基.限制性内切酶，T4DNA连接酶及高保真PfuTaqDNA聚合酶购自英国NEB公司；NiSO4，BSA，DNA胶回收，质粒抽提及细菌基因组抽提试剂

8、盒均购自上