极端嗜热天冬氨酸激酶在大肠杆菌中克隆表达、纯化及酶学性质研究

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1、极端嗜热天冬氨酸激酶在大肠杆菌中克隆表达纯化及酶学性质研究中文提要天冬氨酸激酶(Aspartokinase，4．aspartate13-phosphotransferase，EC2．7．2．4，简称AK)广泛存在于植物、细菌和真菌体内，是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径中的关键酶，该生物合成途径生成L一赖氨酸、L一苏氨酸和L一甲硫氨酸。AK催化底物L一天冬氨酸和ATP生成天冬氨酰一p．磷酸和ADP，是天冬氨酸途径的第一步反应，也是整个天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的限速步骤，其活性受该途径末端产物氨基酸的反馈抑制。因此，天冬氨

2、酸激酶的研究受到很多学者的关注。在植物和微生物中，天冬氨酸途径生成苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸等四种必需氨基酸，因此通过阐明天冬氨酸激酶的结构、性质和代谢调控机理，使得该酶能够作为靶酶开发新型的除草剂和医药化合物来控制杂草、真菌和细菌。在农作物和生产菌选育研究中，通过筛选抗反馈抑制的天冬氨酸激酶获得高活性AK是提高农作物和工业微生物的赖氨酸和苏氨酸产量的一个有效途径。此外，天冬氨酸途径末端产物赖氨酸是抗生素头霉素和食品保鲜剂多聚赖氨酸￡-Poly-L-lysine的前体，以及其旁支途径产物高丝氨酸是生化杀虫剂AVG

3、(氨基乙氧基乙烯基甘氨酸，aminoethoxyvinylglyeine)的前体，因此通过在分子水平研究天冬氨酸激酶还可以用于构建工业上耐热高效的头霉素和e-PL工程菌，以及改进农作物的AVG水平来应用于农业害虫防治等领域。极端嗜热菌是一类耐高温的微生物，它们的理想生长温度在80℃和110℃之间。Thermusthermophilus是一种极端嗜热的、好氧性的、棒状的革兰氏阴性菌，其生长温度能够达到85。C，具有75℃的最适生长温度。2004年，美国的AllkeHenne等测出了极端嗜热菌Thermusthermophi

4、lusHB27的基因组序列。极端嗜热菌给我们提供了一个新的蛋白质资源，通过研究极端嗜热菌天冬氨酸激酶的性质和结构，不仅有助于理解嗜热蛋白的耐热机制，也有助于理解极端嗜热菌的天冬氨酸的代谢途径，为构建耐热高效的的工程菌、改进农作物的营养含量和农业害虫防治技术等提供基础理论依据。工业用酶的热不稳定性是严重阻碍酶产品开发应用的瓶颈，极端嗜热菌来源的AK由于具有较好的热稳定性，也有望成为有效的工业酶。为获得具有热稳定性的天冬氨酸激酶，本文从极端嗜热菌The，．m淞thermophilusHB27基因组中扩增出天冬氨酸激酶(AK)

5、基因(船助，构建重组质粒，并在EscherichiacoliBL21(DE3)中进行成功表达，得到了较高的表达量。经热处理纯化后测定重组天冬氨酸激酶(tAK)的最适pH为7．5，最适反应温度为80"C。极端嗜热天冬氨酸激酶在大肠杆菌中克隆表达纯化及酶学性质研究中文提要tAK的Km衄P为0．23mmol／L，Vma)【A1P为840．34nmol／(L·min)，KmAsP为0．95mmol／L，Vma】【A印为190．76nmol／(L·min)。赖氨酸和甲硫氨酸对tAK活性没有抑制作用，当苏氨酸浓度大于O．5mmol／

6、L时，对tAK活性有明显抑制作用，并且抑制作用与苏氨酸呈现浓度依赖性。通过在大肠杆菌中成功表达天冬氨酸激酶tAK以及酶学性质的研究，为极端嗜热酶的下一步应用奠定了一定的基础，同时也为阐明极端嗜热菌天冬氨酸代谢途径和调控的研究提供参考依据。关键词：极端嗜热菌，大肠杆菌，极端嗜热酶，天冬氨酸激酶，天冬氨酸途径Ⅱ作者：李敬坡指导教师：蔡平许维岸极端嗜热天冬氨酸激酶在大肠杆菌中克隆表达纯化及酶学性质研究英文提要MolecularCloning，ExpressionandPreliminaryCharac．terizationof

7、aThermostableAspartokinasefromThermusthermophilusHB27inEscherichiacoliAbstractAspartokinase(4·aspartate13-phosphotransferase，EC2．7．2．4，AK)iswildlyexistedinplants，fungiandbacteria,andisakeyenzymeoftheaspartatepathway．AKcatalyzesthephosphorylationofaspartatetoprodu

8、cep-aspartylphosphate，whichisthefirstreactionofthepathway,andalsoistherate—limitedstepinthepathway．TheactivityofAKisundercontrolofthefeedbackinhibitionoftheend