疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶纯化及其编码基因的克隆与表达

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1、山东农业大学博士学位论文疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶纯化及其编码基因的克隆与表达姓名：郭润芳申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：李多川20050520山东农业大学博士学位论文疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶纯化及其编码基因的克隆与表达摘要几丁质酶因其在各个领域潜在的应用价值而倍受关注，它除了被用于植物病原真菌和害虫的生物防治；可以用作外敷药物治疗由真菌引起的人类疾病；可以制备酵母和丝状真菌的原生质体，进行菌株改良。近年来，几丁质酶还用于几丁质的生物转化。几下质经几丁质酶部分水解后产生生物活性物质几丁寡糖，被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环

2、境等许多领域。但采用化学方法控制几丁质降解，难度大，成本高，对环境污染严重。采用生物降解不仅有效的克服了这些问题，而且可以提高资源利用，增加经济效益。国内外已筛选出多种几丁质酶生产菌，并将其分离提纯。但市场应用的几丁质酶主要来源于常温菌，因产品成本高，热稳定性茬，货架寿命短，酶活力和产率低丽制约几丁质酶在农业、工业上的应用。由此可见，热稳定性几丁质酶的研究和开发具有重要的商业价值。尽管已经分离了许多种几丁质酶．相关的基因也已克隆和表达，但有关热稳定性几丁质酶的研究却很少。目前仅从极端耐热古细菌Thermococcuschitonophagus、The

3、rmococclⅡ勋出妇阳P船括KODI、以及细菌BacillusBG一1I、、StreptomycesOPC520、等中分离到对热稳定的几丁质酶，而来源于嗜熟真菌的热稳定几丁质酶还未见报道。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的～种嗜热真菌，从该菌中己分离了多种嗜热酶，但朱见嗜热几丁质酶的报道。本研究中Thermomyceslanuginosus在以胶状几丁质为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了胞外几丁质酶，通过硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Pheny

4、l．Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的几丁质酶。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为48kDa。该酶的最适反应温度和pH分别为55"CN4．5。在pH4．5条件下，该酶在50‘C以下稳定，65。C的半衰期为25rain；70"C保温20rain后，仍保留24％1㈣。Ca”、Na+、K+、Ba2+对酶有激活作用，～些重金属离子Ag+、H92+对酶有显著的抑制作用a而且该酶对齐整小核菌(Sclerotiumrotfsa)和小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)的菌丝生长，疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶的纯化及

5、其编码基因的克隆与表选对串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、番茄灰霉病菌(BotrytiscineFea)的孢子萌发和芽管伸长均有一定的抑制作用。Thermomyceslanuginosus几丁质酶的N一端15个氨基酸序列为AQGYLSVQYFVNWAI，与Aspergillus力migatus、Coniothyriummintans儿丁质酶的N一端氨基酸序列有较高的同源性。根据Thermomyceslanuginosus热稳定几丁质酶CHIT的N_端氨基酸序列和同源保守序列设

6、计简并引物，通过RT-PCR及快速扩增eDNA末端(RACE)的方法，克隆了该几丁质酶的编码基因chit，全长eDNA为1500bp，包含一个由442个氨基酸组成的扦放阅读框。该基因已在GenBank中注册，登录号为DQ092332。由核苷酸序列推导的相应氨基酸序列结构包括N端信号肽序列和催化区，无儿J一质结合区和富含丝苏氨酸区。N一端前43个氨基酸为信号肽序列，完全去除信号肽后，N端氨基酸序列与测定的纯酶N端序列完全一致，切割信号肽后成熟肽大小预测为46kDa。比较几丁质酶的催化区序列，发现与18家族几丁质酶的催化区同源性很高，其中两个基序S—GG

7、W和DG-D-DWE非常保守。这两保守基序与糖基水解酶旧yeosylhydrolases)18家族催化活性有关。其中不变氨基酸残基Asp和Glu为几丁质酶的催化活性位点，因此该酶应属于几丁质酶18家族。将经EcoRI和NotI双酶切的chit基因和原核表达载体pET-30a(+)进行连接，构建成原核表达载体pET／chit，并转化大肠杆菌EcoliBL21(DE3)。经IPTG诱导培养4—5h，目的蛋白得到大量表达，SDS—PAGE电泳检测，在约46kDa处有一条明显的蛋白带，蛋白大小与从该几丁质酶氨基酸序列估计的蛋白分子量相符；而空质粒pE％30a

8、(+)转化BL21经诱导培养后无相应蛋白产生。可溶性分析结果显示，表达的蛋白以包涵体形式存在，这可能由于诱导