嗜热单孢菌角质酶的基因鉴定、高效表达及分子改造

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1、江南大学博士学位论文嗜热单孢菌角质酶的基因鉴定、高效表达及分子改造姓名：陈晟申请学位级别：博士专业：发酵工程指导教师：陈坚20090601摘要从周质空间向培养基中分泌。研究表明，在对数生长中期，添加100mM甘氨酸、1mM表面活性剂TDOC均可将酶活最高点从80h提前至54h；采取重组大肠杆菌在25oC发酵至24h时将培养温度提高至37oC的变温策略对重组蛋白的分泌有促进作用，酶活最高点出现于62h，比不变温的对照提前了18h。4．重组Tfu0882、Tfu0883和Esolanipisi角质酶在水溶液中均以单体形式存在。重组Tfu

2、0882、Tfu0883的最适温度为60oC，并具有良好的热稳定性；重组Fsolanipisi角质酶的最适温度为40oC，热稳定性较差。三种角质酶的最适pH均为8．0，pH稳定范围为6．0．9。0。三种角质酶均能够水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和聚酯，并倾向于水解短链底物，没有位置特异性。Esolanipisi角质酶对州PB底物的亲和力最大，催化效率最高；Esolanipisi角质酶水解PET能力最强，Tfu0883次之，Tfu0882对PET仅有微弱水解。三种角质酶都没有界面活化现象，不需要二价金属离子作为辅助因子，Mn2+对三者有

3、激活作用，CP和H92+对三种角质酶有强烈抑制作用。TritonX．100和Tween20抑制Tfu0882和Tfu0883的活性，对Esolanipisi角质酶无明显作用；SDS对三种角质酶均有竞争性抑制，Tfu0882抑制最弱；TDOC对Fsolanipisi角质酶有明显激活作用。重组Tfu0882和Tfu0883在甲醇、乙醇等多种有机溶剂中具有良好的稳定性，Esolanipisi角质酶在有机溶剂中的稳定性较差。5．以Streptomycesexfoliates脂肪酶晶体结构为模板，通过SWISS．MODEL软件模拟得到Tfu0

4、883和Tfu0882结构模型。模型显示，Zfusca角质酶具有典型的彰B水解酶结构，Tfu0883的活性中心由S170．H248．D216催化三角组成，Tfu0882的活性中心由S188．H266．D234催化三角组成。Zfusca角质酶活性中心上方没有盖子结构，活性中心暴露于溶剂中。角质酶基因Flu0882和m0883在基因组中处在相邻位置，并处于两个不同的操纵子中，受到不同的调控。Tfu0882和Tfu0883在水解角质过程中没有协同作用。在结构模拟的基础上进行理性分析，并成功构建了角质酶突变体Tfu0883．1218A、Tf

5、u0883．W195A／F249A和Tfu0883．Q132A／T101A，催化性质研究表明，突变体对小分子底物的催化没有明显影响；突变体Tfu0883．1218A和Tfu0883-Q132A／T101A水解角质能力明显提高；突变体Tfu0883．Q132A／T101A水解PET聚酯的能力也得到明显提高。关键词：Thermobifidafusca，角质酶，基因鉴定，高效表达，分泌，酶学性质，结构模拟，定点突变IIAbstractCutinaseisakindofhydrolasecapablecatalyzingthecleavag

6、eofesterbondsofcutintoreleasefattyacid．Theydisplayhydrolyticactivitynotonlytowardcutinbutalsoavarietyofsolublesyntheticesters，insolubletriglyceridesandpolyesters．Exceptforhydrolyticactivity，cutinasealsoshowssyntheticactivityandtransesteractivity．Thereforecutinasehasbee

7、nevaluatedasaversatilelipolyticenzymeusedinfoodandchemicalindustry．Rcently．itWasfoundthatcutinasehaspotentialuseincottonbioscouringandsyntheticfibersmodification．Cutinaseistheimportantenzymeintextileindustrycleanproduction．Fungalcutinasehasbeenextensivelyinvestigatedfo

8、rmanyyears．HoweveLbecauseofitslowexpressionlevelandpoorstability,recombinantfungalcutinasehasnotbeenproducedinindustr