资源描述：
《嗜热细菌木糖异构酶基因xyla在酿酒酵母中的高效表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、39卷1期微生物学报Vol.39No.11999年2月ActaMicrobiologicaSinicaFebruary19993嗜热细菌木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中的高效表达鲍晓明高东王祖农(山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100)提要采用PCR技术克隆得到嗜热细菌Clostridiumthermohydrosulfuricum木糖异构酶(xyloseisomeraseXI)基因xylA,将该基因连接于酵母表达载体pMA91的磷酸甘油激酶(PGK)启动子下,得到重组质粒pBX21。通过LiAc完整细胞转化法将重组质粒转移至酿酒酵母(Sac
2、charomycescerevisiae)H158受体菌中,得到重组酵母转化子H612,酶活测定结果表明,成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达。SDS2PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。由酿酒酵母重组子H612产生的木糖异构酶最高酶活条件与其在自然状态下的一致,均为85℃,pH710,在这一条件下酶的比活力为110U/mg蛋白,而在接近酵母最适生长温度的30℃和40℃时,其相对酶活分别下降317%和11%。研究结果显示在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达,为进一步在酿酒酵母菌中建立新的木糖代谢途径打下了基础。关键词
3、木糖代谢,木糖异构酶,xylA,酿酒酵母分类号Q78文献标识码A文章编号000126209(1999)0120049254代谢工程(metabolicengineering)也称途径工程(phthwayengineering),是基因工程的一个重要分支,一般为多基因的基因工程。改变代谢流向,开辟新的代谢途径是代谢工程[1～3]的主要目的之一。木糖是除葡萄糖以外自然界中含量最为丰富的单糖之一,其广泛存在于可再生的木质纤维素材料中,如农副产品及林产业的木质废弃物,以及以农产、林产品为原料的工业[4]如造纸厂废弃物中。当前随着能源危机和环境污染的日益严重,对再
4、生资源的利用已受到广泛的关注,其中对木糖的利用,特别是通过微生物转化木糖产生乙醇的研究也成为[1,2,5～7]热点之一。自然界中存在着某些利用木糖的丝状真菌、酵母菌如树干毕赤氏酵母(Pichiastipitis)、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)和细菌如大肠杆菌(E.coli)、克氏[7]杆菌属(Klebsiellasp.)等。在利用木糖的真菌中,木糖首先经依赖NADPH的木糖还+原酶(xylosereductase,XR)还原形成木糖醇,再由依赖NAD的木糖醇脱氢酶(Xylitolde2[8,9]hydrogenase,XDH)酶促反应
5、形成木酮糖。而利用木糖的细菌中则是在木糖异构酶的[10]作用下直接转化木糖形成木酮糖。酿酒酵母菌由于缺乏将木糖转化为木酮糖的酶,而不能利用木糖,但其可以代谢木糖的异构体形式———木酮糖。木酮糖由木酮糖激酶催化形成52磷酸木酮糖,然后进入磷酸戊糖途径(PPP途径),并经糖酵解途径或在厌氧条件[5,7]下产生乙醇,或在好氧条件下经TCA循环彻底氧化。通过代谢工程手段引入木糖代3山东省自然科学基金资助项目(No.Q97DO1133)收稿日期:1997204225,修回日期:199820121250微生物学报39卷[5,11,12]谢基因,以改变酿酒酵母的代谢途
6、径,使其利用木糖的研究已有不少报道。木糖异构酶(XI)EC5.3.1.5)在细胞体内催化木糖转化成木酮糖,在体外可以转化葡萄糖形成果糖,在工业上用于生产高果糖浆。由于直接完成木糖的木酮糖的转化,并且不需要任何辅助因子,最初认为是构建利用木糖酿酒酵母代谢工程菌株的便利途径。E.coli、Actinoplanesmissouriensis,Bacillussubtilis和Lactobacilluspentosus的木糖异构酶[13～16]基因xylA曾先后被克隆于酿酒酵母菌中,但均没有得到有活性的表达,这一结果一直没有充分的理由以予解释。为此在酿酒酵母中引
7、入木糖木糖醇木酮糖的真菌木[5,6,8.12]糖代谢途径的工作成为构建利用木糖酿酒酵母的另一尝试,大量结果表明,虽然这条途径上的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母菌中均得到高活性的表达,但由于这两步可逆反应的Km值及两酶所用的辅酶不同造成氧化还原平衡失调的影响,导致中间代谢产物木糖醇的积累,严重影响乙醇的形成,使得构建利用木糖酿酒酵母菌的工作处于徘徊的局面,因而有必要重新探讨木糖异构酶在酿酒酵母中的表达及其对发酵木糖产生乙醇的影响。由于嗜热细菌Clostridiumthermohydrosulfuricum的木糖异构酶基因xy
8、lA在茄科植物细胞中得到活性表达(个人通讯),因而本文克隆该基因,并转化酿酒酵母
