黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达

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1、!"卷#期生物工程学报&’()!"*’)#$%%!年"月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12+,(-$%%!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达!!"!$0周亚凤张先恩刘虹张成刚F>B=’>-9GH7II（!中国科学院武汉病毒研究所武汉#0%%"!）（$中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳!!%%!/）（0J;’E=4:;IBK-L4A7KB:4>B，M

2、:A4K;7(H’((4?4’NOE;4>E4，34E=>’(’?-PQ4R;E;>4，S’>R’>，OT"$FU，VW）摘要将黑曲霉葡萄糖氧化酶（GXL）基因重组进大肠杆菌.酵母穿梭质粒AYMH1，转化甲基营养酵母3#0"#+4+&/(5*#&GO!!/，构建出GXL的高产酵母工程菌株。在酵母!.67EB’K及FXZ!基因启动子和终止信号的调控下，黑曲霉GXL在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外，经甲醇诱导0[#R，发酵液中的GXL活力可达0%[#%,:S。OLO.YFG9证实GXL在培养物上清中的含量显著高

3、于其它杂蛋白，约占胞外蛋白总量的5%]["%]，经^O4A=7K’I43Q67IB6(’C离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母GXL比活达#$5_50,:?蛋白，是商品黑曲霉GXL的!_5倍。动力学性质分析表明，重组酵母GXL的6和7分别为02_$/::’(S和0#1$_55I‘!，与商品黑曲霉GXL相比，具有更高的:E7B催化效率。重组酵母GXL的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。关键词葡萄糖氧化酶，甲基酵母3#0"#+4+&/(*#&，基因表达，纯化，动力学分析，生物传感器中图分类号^

4、"21文献标识码F文章编号!%%%.0%5（!$%%!）%#.%#%%.%5葡萄糖氧化酶（G(,E’I4’8;R7I4，9H!)!)0)#，简!材料与方法称GXL）消耗氧气催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯，并释放出a$X$，广泛应用于蛋白脱糖、食品除氧!"!材料及葡萄糖定量分析等，也是迄今为止生物传感器领!"!"!菌株和质粒：甲基营养酵母3#0"#+4+&/(*#&域最主要的工具酶。目前，GXL的大规模生产广泛GO!!/和质粒AYMH1为中国科学院上海生命科学院采用黑曲霉或青霉菌发酵，但黑曲霉和青霉菌发酵生物工

5、程研究中心杨胜利教授馈赠。3载体和黑曲生产GXL过程中，过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶霉1%$1分别购自YK’:4?7公司和美国典型菌种保藏等大量杂蛋白的存在给纯化带来相当的困难［!］。因中心（F3HH），其余菌株和质粒为本室保存或本工作此，构建生产性能优良的GXL产生菌，研制及生产构建。8)0(,#La/!作为受体菌用于质粒AYMH1、3高品质的GXL制剂，具有重要意义。6K4R4K;EbW载体及它们衍生质粒的保存与扩增。c［$］和T=;BB;>?B’>a［0］分别在酿酒酵母中表达了黑!"!"#培养基：大肠杆

6、菌的培养和转化用SJ培养曲霉和青霉菌的GXL基因，获得了具有生物学活性基。酵母的培养、转化和蛋白的诱导生成用UYL、的酿酒酵母GXL。T;BBO等［!］试图在大肠杆菌中表QL、QQ及cL等培养基。达GXL，但活力较低。甲基营养酵母3#0"#+4+&/(*#&培养基组成成分如下：‘!表达系统为2%[1%年代发展起来的优良酵母表达SJ（S）：蛋白胨!%?，酵母膏/?，氯化钠!%?；［#］UYL（S‘!）：蛋白胨$%?，酵母膏!%?，葡萄糖$%?；系统，已成功地表达了数十种相关蛋白。本文采‘!用3#0"#+4+&/

7、(*#&GO!!/高效酵母表达载体，成功地QL（S）：酵母基本氮源培养基（U*J）!_"?，硫构建了GXL高产酵母工程菌株，实现了GXL在甲酸铵/?，葡萄糖$%?，生物素#%%"?；‘!基酵母中的高效表达和分泌，并对重组酵母GXL和QQ（S）：U*J!_"?，硫酸铵/?，甲醇!$:S，生商品黑曲霉GXL的性质进行了比较分析。物素#%%，酪蛋白水解物!%?，Aa/_5；"?收稿日期：$%%%.!$.$/，修回日期：$%%!.%#.%#。基金项目：国家自然科学基金资助（012"%$%#）"通讯作者。34(：25.

8、$".2"5#!#1$；678：25.$".2"5#!#1$；9.:7;(：8)<=7>?@A4>B;,:)C=;’D)7E)E>/期周亚风等：黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达/.%$%!"（#）：&’(%)*+，硫酸铵,+，葡萄糖-.+，生离心去除沉淀。上清液经抽提去除蛋白后，用等体物素/..，琼脂粉0.+，山梨醇%1/)/+。积的异丙醇沉淀酵母基因组"’2。!+!"!"#试剂：