黑曲霉（aspergillus+niger）葡萄糖淀粉酶基因克隆及在毕赤酵母（pichia+pastoris）中分泌表达

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1、南开大学硕士研究生毕业(学位)论文摘要目前对能源短缺和环境污染等诸多问题，乙醇作为替代能源已逐步被人们所认识，成为解决上述问题的有效途径之一。与其他化石燃料相比，乙醇具有可再生、提供清洁的燃烧和不产生温室气体等优点。目前以淀粉为原料高效率发酵生产乙醇主要通过遗传工程构建能够直接发酵淀粉成乙醇的工程微生物，由此也可提高乙醇的产量。葡萄糖淀粉酶是转化淀粉为葡萄糖果糖糖浆的重要工业用酶。本研究的目的在于构建能够分泌葡萄糖淀粉酶并可直接发酵可溶性淀粉为乙醇的重组酵母菌株。根据已发表的黑曲霉葡萄糖淀粉酶eDNA设计一对上下游引物。用RT-PCR方法从黑

2、曲霉总RNA扩增出葡萄糖淀粉酶eDNA，然后将PCR产物连入pMD—T载体构建成为中间载体pMGA，转入大肠杆菌进一步扩增并进行测序。从pMGA载体上用XhoI和EcoRI双酶切下1．8kbDNA片段，将其以符合读码框的方式连入毕赤酵母整合表达质粒载体pPIC9的a一因子下游。新组成的质粒pPIC9一GA经过Sacl酶切线性化后用醋酸锂法转化组氨酸缺陷型毕赤酵母GSll5菌株，DNA插入到其基因组5’AOXl(醇氧化酶)启动子的下游。经营养筛选得到的原养型转化子经O．75％浓度甲醇诱导60小时后，液体培养基上清液中检测到的葡萄糖淀粉酶活性约为

3、1．462IU／ml。表明黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因已能在酵母中表达并能分泌到胞外。关键词：黑曲霉葡萄糖淀粉酶毕赤酵母分泌南开大学硕士研究生毕业(学位)论文AbstractEthanolhasbeenpromotedasasolutionforavarietyofcomplexproblemsrelatedtoenergyandtheenvironment．ComparedtOfossilfuels，ethanolhastheadvantagesofbeingrenewable，providingcleanerburningandproducin

4、gnogreen—housegases．MethodsforthefermentativeproductionofethanolfromstarchincludeusingageneticallyengineeredmicroorganismthatCalldirectlyfermentstarchintoethanolandhenceleadtoanincreaseintheproductivityofethan01．Glucoamylaseisanindustriallyextremelyimportantenzyme，usedinthe

5、enzymaticconversionofstarchintohighglucoseandfructosesyrups．Thepurposeofthisstudyistoconstructaglucoamylaseproducingrecombinantyeaststrainsforthedirectfermentationofsolublestamhintoethan01．Inthisstudy,twoprimersweredesignedaccordingtothepublishedsequenceofAspergillusnigergl

6、ucoamylaseeDNA．TheglucoamylaseeDNAofAnigerwasamplifiedbythemethodofRT-PCRfromthetotalRNAofAniger．Then，thePCRsegmentwasclonedintopMD—TvectortoconstructthemiddlevectorpMGAthatWasthentransformedinto最colitoamplifyandsequence．The1．8kbsegmentwasacquiredbydigestingpMGAusingXhoIand

7、EcoRImadligatedwithPichiapastorisintegrativeexpressionvectorspPIC9fcontaininga-factor)．ConsequentlytheplasmidspPlC9一GAWaSlinearedbySaclandinsertedintoPichiapastorisGS15(His‘)genomedownstreamofthe5jAOXlpromoterbythemethodoflithiumacetate．Inductionby0．75％methanolfor60hledtOsy

8、nthesisofsecretedglucoamylasetogivearound1．462IU／m1．Soitisdemonstratedthatthegluco