福氏志贺菌ipaB基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

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1、!"卷"期微生物学报&’()!".’)"#$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!福氏志贺菌&.$/基因的克隆及其在酵母细胞中的表达#00#0"姚潇王恒!闫晓宇杨伯伦黄留玉（0军事医学科学院生物工程研究所北京0$$$D0）（#陕西师范大学生命科学学院西安D0$$%#）关键词：福氏志贺菌，!"#$基因，表达中图分类号：FD9%文献标识码：G文章编号：$$$0:%#$1（#$$"）$":$!09:$!志贺氏菌引起的细菌性痢疾为一

2、种全球性的肠道传染病。据估计，全世界每年感染的人数超过两［0］亿，由该病引起的死亡人数有%3万左右。该菌的致病性是由体内含有#"$HC的毒性大质粒决定的，［#，"］而大质粒上一个"0HC的片段所编码的侵袭质粒抗原（I,J7K=’,L(7K<=M7,E=?-,，IL7）是致病所必需的。［!，3］近年来，国内外有关学者在原核生物中对!"#$基因克隆及功能进行了较广泛的研究，但在酵母细胞中这方面的研究未见报导。从志贺痢疾杆菌中克隆了!"#$基因，并在酵母细胞中得到了融合表达，为将IL7N应用于双杂交系统研究其在侵袭过程中的分子机制打下了基础。!材料和方法!"!菌株和质

3、粒研究所用菌株和质粒见表0。表!菌株和质粒菌株或质粒遗传型及性状来源%O&’()*(+!#7#!3D4P=(ME@L-，.7(QR7+Q-((=G4,)-.’!S/3!T+L;!!，"(7BU0%1，>KMV0D，Q-BG0，-,MG0，?@QG1%，E>=W0，Q-(G0，.7(Q2INXY5NVZ%)-(+(/!0!#(G/0$1RG47，EQLW，(-+W，>=KW，GM-W，Z7B[WX(’,E-B>L2N4D2GZ!SNS，4V]0，B:R@BE7?，7,QX(’,E-B>L2N4:=L7NIL7N^+K-ME’2GZ!SNS，4V]0，B:R@

4、BE7?，7,Q4>=KP’QH!"#菌株培养痢疾杆菌#!3D4先在含$)$#3_刚果红的4TG（4Q@LE=KB7K-K’@7?7Q）平皿上划线培养，挑取红色菌落接种于4TN（4Q@LE=KB7K-K’@CQ’E>）培养基在"D‘摇床培养。S/3!用ZN培养基培养、酵母菌G/0$1用a]GS培养基培养、G/0$1转化后用TS5:4QL培养基筛选培养。抗生素工作浓度：卡那霉素（7,）3$#?5Z，萘啶酮酸（.7(）!$#?5Z。!"$工具酶及化学试剂限制性内切酶，4!S.G连接酶、1#2S.G聚合酶、]XV片段回收试剂盒为477V7公司产品；质粒提基金项目

5、：首都二四八重大创新工程（/$0$#0$"%$001）；国家重点基础研究发展规划项目（20111$3!0$"）"通讯作者。4-(5678：9%:0$:9"9#0$!!；;:<7=(：>+7,?(@A,=B)C<=)7B)B,作者简介：姚潇（01%D:），男，陕西周至人，博士研究生，主要从事基因工程研究。;:<7=(：@7’8=7’3$A>’E<7=()B’<收稿日期：#$$#:$9:"$，修回日期：#$$#:00:01F期姚潇等：福氏志贺菌’()*基因的克隆及其在酵母细胞中的表达E:C取试剂盒为!"#$%&’公司产品。()*+(单克隆抗体、,!-和.-/)0"1

6、培养基购自23#45%(6公司。!"#!"#$基因的扩增取78!9培养过夜的痢疾杆菌，离心弃上清后加等体积去离子水，沸水煮:8$;4后离心，取菌裂解液的上清7$$#3/9的?@0!A!9，:8B!2=缓冲液:8!9，<8!$#3/9的引物!:、!<各:!9，补水至:88!9。反应条件为：C7DE$;4后，按下列参数循环F8次，C7D变性F8G，7

7、MD连接过夜。连接产物转化大肠杆菌-N7"，提取重组质粒酶切鉴定。!"%序列测定取酶切鉴定正确的重组质粒进行测序，由上海博亚生物工程有限公司完成。!"&酵母细胞的转化按文献［M］用醋酸锂法将1JKL0);1’K转化酵母ON:8C细胞，铺.-/)0"1平板筛选。!"’酵母蛋白的提取挑取<$$PF$$大小的菌落过夜培养后，按23#45%(6公司提供的操作说明，用尿素/.-.法提取酵母蛋白质。!"()*)+,-./和01231456783395:分析按文献［H］对表达产物进行.-.)!OJQ和R%G5%"4S3#55;4&分析。由于1JKL0H质粒在表达与JO9E的融

8、合蛋白中含有()*+(标