志贺菌外排泵基因emre的克隆表达及进化分析

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1、志贺菌外排泵基因emrE的克隆表达及进化分析作者：吴健张少平穆瑞瑞丁毅郗园林段广才【摘要】目的研究志贺菌外排泵基因emrE的耐药功能及其进化。方法以志贺菌临床多重耐药株H24基因组为模板，扩增出含emrE基因的1126bpDNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α，对阳性克隆酶切鉴定和测序；用琼脂平皿二倍稀释法对重组菌株进行药敏测定并测定泵抑制剂CCCP对MIC值的影响；通过RT-PCR从mRNA水平检测emrE的表达水平；通过Genbank数据库对基因序列进行同源性比对，建立进化树并

2、分析同源基因之间的关系。结果含emrE基因质粒可以提高大肠埃希菌对四环素耐药性1倍，对红霉素的耐药性1倍；对emrE基因的同源分析显示H24菌株和大肠埃希菌、其它志贺菌可归为相近一族，同源性在92%以上，与同属于肠杆菌科的欧文杆菌和沙门菌的同源性分别为70%和60%；与亲缘关系较远革兰阳性菌除虫链霉菌和结核分枝杆菌的同源性仅为47%和48%。结论志贺菌耐药株H24的emrE基因与对四环素及红霉素的耐药性相关，依据现有数据进行的emrE基因同源分析未发现有明显的基因水平转移现象。【关键词】志贺菌；emrE基因；外排

3、泵；耐药；基因水平转移ABSTRACTObjectiveTostudythefunctionandphylogeicsoftheactiveeffluxpumpgeneemrEinclinicalisolatesofShigella.MethodsTheactiveeffluxpumpgeneemrEplifiedbyPCRandligatedidtoconstructtherebinantpMD-emrE,andthepMD-emrEedintoE.coliDH5α.Thepositivebacterialcl

4、onesedigestion,andthegeneofisolatesethod;phylogenictreeGenbank.ResultsPlasmidpMD-emrEcanelevatetheresistancelevelofE.colitotetracyclinbyonefoldanderythromycinbyonefold.AnalysisofemrEphylogenictreeindicatedthatstrainH24,allstrainsofE.coliandallotherstrainsofSh

5、igellacouldbeclassifiedintoonegrouponella,ycesavermitilisandMycobacteriumtuberculosisrEycininthedrugresistancestrainH24.PhylogenictreeanalysisindicatesitrEtodevelophorizontalgenetransferringamongdifferentbacterialgenomes.KEYR)。SMR耐药泵家族是已知细菌中最小的多重耐药外排泵。通常由100多

6、个氨基酸组成，形成四个跨膜螺旋。前3个跨膜螺旋为双亲性，含有许多保守的谷氨酸、丝氨酸、酪氨酸及色氨酸残基，这些残基的侧链与底物的疏水区域直接作用而介导它们的跨膜转运。SMR转运蛋白为PMF能量来源型(第二类主动外排系统)［10］。SMR家族成员均来自于细菌，其中最典型的是大肠埃希菌的EmrE泵。通过对大肠埃希菌的EmrE泵研究发现SMR耐药泵是通过多聚体的形式发挥功能的，形成同源三聚体［11，12］或四聚体［13］。目前已在多种菌株中发现emrE外排泵基因的分布，但其序列有较大差异，其进化意义和生理意义尚不十分明

7、了。大肠埃希菌中emrE编码的外排泵蛋白能引起对甲基紫精、四苯溴化磷、溴化乙啶、吖啶黄、结晶紫及红霉素、四环素和磺胺嘧啶等的耐药性［14，15］。本文报道克隆了包括调控序列在内的完整志贺菌emrE耐药泵基因，并在大肠埃希菌中测定了它的耐药特性，同时初步分析了该基因在细菌中的分布和进化关系，为近一步进行耐药性研究奠定了基础。1材料与方法1.1材料(1)菌种及质粒大肠埃希菌DH5α及临床分离志贺菌多重耐药株H24由郑州大学公共卫生学院流行病教研室收集保存；大肠埃希菌药敏质控株ATCC25922由河南省疾病预防控制中心

8、惠赠；pMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。pMD18-T载体由pUC18改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切后，再在两侧的3′端添加“T”而成。它易于与PCR产物联接并与pUC18具有相同的功能，选择标记为氨苄西林抗性基因，通常用作克隆载体，但也能适度表达。(2)工具酶及试剂SacI