志贺氏菌外排泵基因emre克隆表达及进化的分析

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1、郑硕士州大学位授予单位代码：学号或申请号：密级：，警于论文1045904301037论文题目：志贺氏菌外排泵基因emrE的克隆表达及进化分析作者姓名：张少平学科门类：理学专业名称：细胞生物学导师姓名、职称：吴健教授二oo七年五月摘要志贺氏菌属(Shigella)细菌，是人类及灵长类动物细菌性痢疾(简称菌痢)00致病菌，是急性感染性腹泻的主要病原体之一，主要流行于发展中国家，但发达国家也时有爆发。由于大量抗生素的不断使用，导致志贺氏菌属细菌的耐药性逐年增加，使治疗难度有增大的趋势。主动外排机制在细菌多耐药性产生机制中发挥着主要作用。目前研究已证实了志贺

2、氏菌中存在着多种耐药外排泵蛋白。为了解志贺氏菌属细菌的多重耐药泵emrE的功能及其进化，本研究采用琼脂二倍稀释法测定抗生素对l临床收集的志贺氏菌最低抑菌浓度，发现这10株多耐药志贺氏菌株的耐药谱有一定差异，从中筛选出临床多耐药株H2,，并对其进行血清学鉴定，证实多耐药株H24为宋内氏志贺氏菌。利用PCR技术从宋内氏志贺氏菌多耐药株H24总DNA中克隆到包含自身启动子的DNA片段。将该片段插入到原核克隆载体pMDl8-T中，转化大肠杆菌DH50，对重组质粒进行酶切鉴定，证实重组菌株构建成功。对emrE基因进行测序，在此基础上进行同源性比较并构建进化树。

3、测序结果表明该片段与Genbank中的宋内氏志贺氏菌株S．sonneiSs046的emrE基因碱基序列完全一致，进化树分析显示emrE基因在不同细菌的基因组间无水平转移的迹象。采用琼脂二倍稀释法检测重组菌株在加入泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)前后对七种抗生素的最低抑菌浓度(MIC值1的变化情况。结果发现相对于未携带emrE的对照菌株pMD(DHSo)，重组菌株pMD-emrE(DH50)对四环素和红霉素的MIC值分别提高了1倍和2倍，而对其它抗生素却无明显效果。加入泵抑制剂CCCP后重组菌株及对照株的耐药程度则无明显差异。证明eazrE介导的四环素和红

4、霉素的耐药与质子外排泵相关。提取重组菌株及对照株的菌体总RNA，以大肠杆菌内稳定表达的看家基因gapA内部的380bp片段作为内参，gapA基因编码大肠杆菌的甘油醛一3一磷酸脱氢酶，RT-PCR检测主动外排基因emrE在重组株和对照株中的表达水平。结果发现pMD—emrE(DI-ISo)重组菌emrE基因的表达水平比pMD(DH50)空白对照株有显著提高。本研究结果表明：志贺氏菌多耐药株emrE基因介导对四环素和红霉素的抗性，这种能力可能与编码区基因的突变无关，而与emrE基因编码蛋白的表达量升高有关。通过对emrE基因的同源分析并没有发现明显的细菌

5、基因组间的水平转移现象。关键词t志贺氏菌：emrE基因；外排泵；耐药：水平转移；AbstractSh弛／／aisthemainpathogenofshigellosis．Itisanepidemiccontagionthroughouttheworld，especiallyinthedevolopingcountries．Sinceantimicrobialagentswerewidelyusedtotreatshignliosis，antimcrobialresistanceinShigellahasbeenwidelydispreaded．Now

6、increasingnumbersofShigellaexhibitresistancetomultipleantibacterials，whichconstitutesgreatdifficultytothepreventionandtreatmentofshigellnsis．Activeeffluxisamajormechanismofresistancetodragsinpathogenicmicroorganisms．Manyinvestigationshaverevealedthepresenceofeffluxtransportersi

7、nShigella．TostudythefunctionandevolutionoftheactiveeffiuxpumpgeneemrEinclinicalisolatesofShigella，antibioticssusceptibilityofthetenclinicalstrainsofShigellawastestedbythetwofoldagardilutiontechnique．Theresultsshowedthatthestrainswereresistanttomanykindsofantiobiotics．Finally，th

8、estrainH24wasselectedforitssignificantantiobioticresis