鼠伤寒沙门氏菌外排泵AcrAB失活对其它外排泵表达的影响.pdf

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1、学校代码：10564学号：2013202722分类号：S859.7密级：硕士学位论文鼠伤寒沙门氏菌外排泵AcrAB失活对其它外排泵表达的影响杨磊指导教师：蒋红霞教授学院名称：兽医学院专业名称：基础兽医学答辩委员会主席：曾振灵教授中国·广州2016年6月摘要沙门氏菌是一类主要食源性病原菌，在沙门氏菌诱发感染病例中,鼠伤寒沙门氏菌占很高的分离率。氟喹诺酮类药作为治疗沙门氏菌病的首选药物被广泛用于临床。在氟喹诺酮类选择压力下，鼠伤寒沙门氏菌很快对其产生耐药，其中最主要的耐药机制是增强的外排作用和拓扑异构酶突变。本实验选取敏感的鼠伤寒沙门氏菌临床株SH10作为亲本菌，建立了

2、pKD46和噬菌体P22介导的基因敲除的方法。为研究AcrAB-TolC及其调控因子对SH10敏感性的作用，我们分别构建了外排泵和调控因子的基因缺失株并采用二倍琼脂稀释法测定了缺失株的MIC。结果显示，与原菌SH10相比，这些缺失株对受试的15种抗生素的MIC值没有发生明显的变化，表明缺失acrAB及其调控因子没有对SH10的药物敏感性产生显著的影响。另外，我们在半固体培养基上测定了这些缺失株的迁移力。数据显示，缺失marA、ramA和soxR后，细菌在培养基上移动的半径由27mm下降至18.3-21.7mm（P<0.05或P<0.01）；而缺失marR、ramR和

3、soxS时，细菌的移动半径由27mm升高至31-33.7mm(P<0.05)。缺失acrA或acrB时，细菌的移动半径也增大，但变化不显著；而缺失tolC时，细菌的移动半径减小。以上结果表明，转录调控因子marA、ramA和soxR对鼠伤寒沙门氏菌SH10的迁移力起着正向调控的作用。为研究鼠伤寒沙门氏菌耐多药外排泵AcrAB-TolC是否存在反馈调节机制，我们检测了SH10在加入外排泵抑制剂PAβN后acrAB-tolC各基因的表达情况，以及缺失acrA或acrB后剩余外排泵基因和调控因子的表达水平。荧光定量数据显示，加入PAβN后，acrA和acrB的表达水平升高

4、到原来的2.32倍和1.57倍，marA和ramA的表达水平分别提高到原来的1.40倍和2.94倍。当缺失acrA时，acrB和tolC的表达水平升高到原来的2.92倍和2.48倍，而marA和ramA则分别升高到原来的2.29倍和2.89倍。当缺失tolC时，acrA和acrB的表达升高了2.48倍和2.45倍，marA和ramA分别升高了3.03倍和3.07倍。因此，当沙门氏菌外排泵AcrAB-TolC功能失活时，细菌会通过激活转录调控基因ramA和marA反过来促进acrAB-tolC的表达。为研究鼠伤寒沙门氏菌SH10主要外排泵acrAB与其余外排泵间的关系

5、，我们量测定了∆acrAB::kan缺失株中另外八种外排泵基因acrF、acrD、mdsB、mdtB、macA、emrA、mdfA和mdtK的表达水平。除mdtK外，其余的外排泵的I表达水平均不同程度上调（1.59-2.26倍，P<0.05）。同样地，我们还检测了通过P22构建的∆acrABmarA::kan、∆acrABramA::kan和∆acrABsoxS::kan双基因缺失株中另外八种外排泵的表达情况。结果显示，缺失∆acrAB::kan中的调控基因marA、ramA和soxS，可使缺失株中其它外排泵的表达水平显著地降低（0.26-0.85倍、0.18-0.

6、88倍和0.27-1.26倍，P<0.05）。另外，我们也检测了∆acrEF::kan、∆acrD::kan、∆mdtABC::kan、∆mdsABC::kan、∆macAB::kan、∆emrAB::kan、∆mdfA::kan和∆mdtK::kan中acrAB-tolC及其调控因子的表达情况。结果显示，在这八株外排泵缺失株中，acrAB-tolC及其转录调控基因marA和ramA的表达水平都显著的增加(P<0.05)，而且其迁移力也有所增强。以上结果表明，沙门氏菌SH10可以通过marA和ramA来实现acrAB与其它外排泵间的相互调节。在环丙沙星的选择压力下，

7、我们在体外筛选出鼠伤寒沙门氏菌临床株SH10和标准株SL1344的不同耐药水平的诱导菌。其中SH-1和SL-1为敏感性降低株（MICcip为0.125μg/mL和0.25μg/mL），SH-2和SL-2为低水平耐药株（MICcip均为2μg/mL），SH-3和SL-3为高水平耐药菌（MICcip为8μg/mL）。QRDR突变检测结果显示，这些不同耐药水平的诱导菌中，只在GyrA的83位检测到突变S83F。于是，我们又检测了诱导菌中主要耐多药泵acrAB-tolC及其主要的转录激活因子ramA、marA和soxS的表达情况。结果显示，随着耐药水平的升高，外排泵的表