胆固醇氧化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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1、摘要胆固醇氧化酶基因是近几年才发现的一种抗虫基因。胆固醇氧化酶对其敏感害虫一鞘翅目的棉铃象甲的毒杀能力与早期发现的Bt.毒蛋白相当，对鳞翅目的一些害虫如烟蚜夜蛾等也有较强的抑制其生长发育的作用。因为它的毒杀能力强，而且其杀虫谱又与现在广泛使用的Bt.毒蛋白具有一定的互补性，所以被认为是继Bt毒蛋白之后的第二代杀虫蛋白的代表之一。另外，在临床上胆固醇氧化酶可以与胆固醇脂酶和过氧化氢酶一起作为血浆总胆固醇含量的检钡赋剂，用以诊断冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病。因此，对胆固醇氧化酶的研究越来越受到重视。本研究采用

2、PCR方法从分泌胆固醇氧化酶的马红球菌菌株42G2基因组DNA中，扩增出特异DNA片段，该扩增片段全长约1.6kb。对片段进行克隆、亚克隆之后测序分析，发现与己克隆的来源于马红球菌的胆固醇氧化酶基因choE有99的同源性;并且三次独立的PCR均得至湘同的片段，所克隆的基因序列与chcE相比，连续缺失三个碱基〔TTC).即相应的氨基酸序列缺失一个氨基酸(Phe)，因此判断所克隆的基因片段与choE属同一基因家族或原有基因的天然突变体，命名为choEW,利用pET-His等不同表达载体和大肠杆菌TOP10F,BL2

3、1(DE3)plysS表达宿主菌，成功构建了胆固醉氧化酶基因的不同原核表达系统.其结果经SDS-PAGE分析表明:以pET-His为表达载体，大肠杆菌B121(DE3)plysS为宿主菌的重组表达系统表达出约56kD的特异蛋白，蛋白大小与预期结果相一致。经过氧化氢酶法检测表达蛋白，表明表达产物具有胆固醇氧化酶酶活。本研究从我国自行分离的马红球菌42G2菌株中分离到一种编码胆固醇氧化酶的新基因choEW，它将可应用于临床检测、保健食品和农业抗虫等领域;同时利用原核表达载体成功的在大肠杆菌中表达了目的基因，表现出胆

4、固醇氧化酶酶活，为胆固醇氧化酶的基因工程利用开发作了一定的理论实验蜘韵研究。胆固醇氧化酶，抗虫基因，原核表达AbstractCholesteroloxidaseisatypeofproteinthatwasfoundtohavepest-resistantactivity。吻yearsago,itstoxitytosuchsensitivepestsascottonbollweeviliseuqivalenttopreviouslyfound及endotoxins.Theproteincanalsoinhibi

5、tthegrowthanddevelopmentofcottonbol~·BecauseofitshightoxityactivityandcomplementaryinseticidalspectrumwithBt.endotoxinwhichisnowbeinguseduniversally,thecholesteroloxidaseisacknowlegedasoneoftherepresentitiveoftheinsecticidalproteinofthesecondgeneration.Moreo

6、ver,togetherwithcholesterolesteraseandcatalyse,cholesteroloxidasecanbeusedastestreagenttodeterminethetotalcholesterolcontentinbloodplasmaforthediagnosisofsuchascardiovascularreflexandatherosclerosisclinicaly.Therefore,researchoncholesteroloxidasehasbecomemor

7、eandmore加po比过t.A1.6kbDNAfragmentwasamplifiedusingPCRmethodfromgenomicDNAofRhodococcwequ,42G2.Sequenceanalysisshowedthat,thisfragmenthasahomologyof99%tothepreviouslyreportedchoEfromRhodococcuseqwaftercloningandsubcloningandthreeidenticalfragmentswereobtainedf

8、romthreeindependentPC民lackingthreecontinualbases(TC,encodingthePheaminoacid)comparedwithchoE,thusitcanbeassumedthatthenewfragment,designatedaschoEW,andchoEbelongtothesamegenefamily,evenitmightbe