大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达论文

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1、大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达论文安家泽，宋振顺，窦科峰，李开宗，韩骅【关键词】基因克隆【Abstract】AIM:Toobtainlargeamountofratbetacellulinsoastoexplorethefunctionoftheproteinandpreparetheantibodyagainstthisprotein.METHODS:A544bpofratbetacellulingenefragmentplifiedbyPCRmethodfromratkidneyandclonedintopET28a（+）vector,anE.co

2、liexpressionvector,toconstructarebinantplasmidpET28arBTC.TheplasmidedintoE.coliBL21(DE3)andinducedtoexpressbetacellulinolecularostininclusionbodysections.CONCLUSION:Cloningandexpressionofbetacellulingenelayabasisforthefurtherstudyonthefunctionofthisproteinandpancreaticstemcelldifferent

3、iation.【Keyacia公司产品);ECL发光试剂(PIERCE公司).1.2方法1.2.1β细胞素基因的扩增及序列测定①引物设计合成：根据GenBank中大鼠β细胞素基因序列，设计引物，上游引物序列为：5′ACACAGCACGGTTGATGG3′(18bp)，下游引物：5′CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3′(20bp)，其中上、下游引物的5′端分别引入EcoRI和SalI酶切位点.②目的基因的扩增及序列测定：应用PCR试剂盒扩增目的基因，总反应体积为50μL，循环参数为：95℃4min;95℃30s,55℃30s,72℃1min，35个循环，再于7

4、2℃延伸7min.③目的基因的序列测定：将PCR扩增产物克隆入载体pMD18T中,构建pMD18TrBTC，酶切鉴定正确后，交由上海生工公司进行DNA序列测定.1.2.2β细胞素原核表达载体的构建以EcoRI和SalI双酶切经测序正确的PMD18TrBTC，获取β细胞素基因.以EcoRI和SalI双酶切pET28a（+）载体，分别回收β细胞素基因和pET28a（+）载体片段，SolutionI连接上述基因和载体片段，构建β细胞素原核表达载体pET28（a+）rBTC，转化E.coliXL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，小量提取质粒并酶切鉴定.1.

5、2.3β细胞素的原核表达及检测以β细胞素原核表达载体pET28（a+）rBTC转化E.coliBL21感受态细胞，挑取用含卡那霉素的LB平板筛选的阳性克隆于LB培养基中，37℃振摇过夜，按1∶100转接到LB培养基2mL中，37℃振摇约3h，使A600nm约0.6（0.4~1.0），加入终浓度0.5mmol/L的IPTG继续培养诱导3h.于4℃离心15000g×1min，收集菌体并裂解，4℃离心15000g×10min，分别取上清及沉淀（包涵体），进行SDSPAGE和D18T，形成pMD18TrBTC，酶切鉴定得到正确克隆，以M13+/M13-为引物进行序列测定.测

6、序结果与GenBank中大鼠β细胞素基因序列比对无突变.2.2大鼠β细胞素原核表达载体pET28arBTC构建用EcoRI和SalI双酶切pMD18TrBTC，回收片段后与经过相同酶切的pET28a（+）片断连接，转化E.coliXL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑单克隆扩增小量提取质粒并酶切鉴定.EcoRI和SalI双酶切得到的片段，与预期的大小一致.2.3pET28arBTC的原核表达及鉴定将原核表达载体pET28arBTC转化到E.coliBL21感受态细胞中，经IPTG诱导后，可见Mr为20000的融合蛋白，主要以包涵体形式表达.以an

7、tiHis一抗做aruiT,etal.Expressionofbetacellulin,heparinbindingepidermalgroanmalignantfibroushistiocytoma［J］.AnticancerRes,2004;24(3b):2007-2010.［4］LiL,SenoM,YamadaH,etal.Promotionofbetacellregenerationbybetacellulininniypercentpancreatectomizedrats［J］.Endocrinology,2001;142(12):5379-5385