大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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1、大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达:安家泽,宋振顺,窦科峰,李开宗,韩骅【关键词】基因克隆  【Abstract】AIM:Toobtainlargeamountofratbetacellulinsoastoexplorethefunctionoftheproteinandpreparetheantibodyagainstthisprotein.METHODS:A544bpofratbetacellulingenefragmentplifiedbyPCRmethodfromratkidneyandclonedintop

2、ET28a(+)vector,anE.coliexpressionvector,toconstructarebinantplasmidpET28arBTC.TheplasmidedintoE.coliBL21(DE3)andinducedtoexpressbetacellulinolecularostininclusionbodysections.CONCLUSION:Cloningandexpressionofbetacellulingenelayabasisforthefurtherstudyonthefunctionof

3、thisproteinandpancreaticstemcelldifferentiation.  【Keyacia公司产品);ECL发光试剂(PIERCE公司).  1.2方法  1.2.1β细胞素基因的扩增及序列测定①引物设计合成:根据GenBank中大鼠β细胞素基因序列,设计引物,上游引物序列为:5′ACACAGCACGGTTGATGG3′(18bp),下游引物:5′CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3′(20bp),其中上、下游引物的5′端分别引入EcoRI和SalI酶切位点.②目的基因的扩增及序列测定:应用PC

4、R试剂盒扩增目的基因,总反应体积为50μL,循环参数为:95℃4min;95℃30s,55℃30s,72℃1min,35个循环,再于72℃延伸7min.③目的基因的序列测定:将PCR扩增产物克隆入载体pMD18T中,构建pMD18TrBTC,酶切鉴定正确后,交由上海生工公司进行DNA序列测定.  1.2.2β细胞素原核表达载体的构建以EcoRI和SalI双酶切经测序正确的PMD18TrBTC,获取β细胞素基因.以EcoRI和SalI双酶切pET28a(+)载体,分别回收β细胞素基因和pET28a(+)载体片段,Solution

5、I连接上述基因和载体片段,构建β细胞素原核表达载体pET28(a+)rBTC,转化E.coliXL10感受态细胞,用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆,小量提取质粒并酶切鉴定.  2结果  2.1β细胞素基因的扩增、克隆及序列测定β细胞素基因的PCR产物10g/L琼脂糖凝胶电泳可见544bp特异性条带(Fig1),回收片段后插入pMD18T,形成pMD18TrBTC,酶切鉴定得到正确克隆,以M13+/M13-为引物进行序列测定.测序结果与GenBank中大鼠β细胞素基因序列比对无突变.  2.2大鼠β细胞素原核表达载体pET28

6、arBTC构建用EcoRI和SalI双酶切pMD18TrBTC,回收片段后与经过相同酶切的pET28a(+)片断连接,转化E.coliXL10感受态细胞,用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆,挑单克隆扩增小量提取质粒并酶切鉴定.EcoRI和SalI双酶切得到的片段,与预期的大小一致.  2.3pET28arBTC的原核表达及鉴定将原核表达载体pET28arBTC转化到E.coliBL21感受态细胞中,经IPTG诱导后,可见Mr为20000的融合蛋白,主要以包涵体形式表达.以antiHis一抗做,etal.ActivinAandb

7、etacellulin:Effectonregenerationofpancreaticbetacellsinneonatalstreptozotocintreatedrats[J].Diabetes,2004;53(3):608-615.  [3]YamamotoT,AkisueT,MaruiT,etal.Expressionofbetacellulin,heparinbindingepidermalgroanmalignantfibroushistiocytoma[J].AnticancerRes,2004;24(3b):

8、2007-2010.  [4]LiL,SenoM,YamadaH,etal.Promotionofbetacellregenerationbybetacellulininniypercentpancreatectomizedrats[J].Endocrinology,2001

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