资源描述：
《大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达：安家泽，宋振顺，窦科峰，李开宗，韩骅【关键词】基因克隆 【Abstract】AIM:Toobtainlargeamountofratbetacellulinsoastoexplorethefunctionoftheproteinandpreparetheantibodyagainstthisprotein.METHODS:A544bpofratbetacellulingenefragmentplifiedbyPCRmethodfromratkidneyandclonedintop
2、ET28a（+）vector,anE.coliexpressionvector,toconstructarebinantplasmidpET28arBTC.TheplasmidedintoE.coliBL21(DE3)andinducedtoexpressbetacellulinolecularostininclusionbodysections.CONCLUSION:Cloningandexpressionofbetacellulingenelayabasisforthefurtherstudyonthefunctionof
3、thisproteinandpancreaticstemcelldifferentiation. 【Keyacia公司产品);ECL发光试剂(PIERCE公司). 1.2方法 1.2.1β细胞素基因的扩增及序列测定①引物设计合成：根据GenBank中大鼠β细胞素基因序列，设计引物，上游引物序列为：5′ACACAGCACGGTTGATGG3′(18bp)，下游引物：5′CCAGCTTGTGGTAACTTTAT3′(20bp)，其中上、下游引物的5′端分别引入EcoRI和SalI酶切位点.②目的基因的扩增及序列测定：应用PC
4、R试剂盒扩增目的基因，总反应体积为50μL，循环参数为：95℃4min;95℃30s,55℃30s,72℃1min，35个循环，再于72℃延伸7min.③目的基因的序列测定：将PCR扩增产物克隆入载体pMD18T中,构建pMD18TrBTC，酶切鉴定正确后，交由上海生工公司进行DNA序列测定. 1.2.2β细胞素原核表达载体的构建以EcoRI和SalI双酶切经测序正确的PMD18TrBTC，获取β细胞素基因.以EcoRI和SalI双酶切pET28a（+）载体，分别回收β细胞素基因和pET28a（+）载体片段，Solution
5、I连接上述基因和载体片段，构建β细胞素原核表达载体pET28（a+）rBTC，转化E.coliXL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，小量提取质粒并酶切鉴定. 2结果 2.1β细胞素基因的扩增、克隆及序列测定β细胞素基因的PCR产物10g/L琼脂糖凝胶电泳可见544bp特异性条带（Fig1），回收片段后插入pMD18T，形成pMD18TrBTC，酶切鉴定得到正确克隆，以M13+/M13-为引物进行序列测定.测序结果与GenBank中大鼠β细胞素基因序列比对无突变. 2.2大鼠β细胞素原核表达载体pET28
6、arBTC构建用EcoRI和SalI双酶切pMD18TrBTC，回收片段后与经过相同酶切的pET28a（+）片断连接，转化E.coliXL10感受态细胞，用含卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑单克隆扩增小量提取质粒并酶切鉴定.EcoRI和SalI双酶切得到的片段，与预期的大小一致. 2.3pET28arBTC的原核表达及鉴定将原核表达载体pET28arBTC转化到E.coliBL21感受态细胞中，经IPTG诱导后，可见Mr为20000的融合蛋白，主要以包涵体形式表达.以antiHis一抗做,etal.ActivinAandb
7、etacellulin:Effectonregenerationofpancreaticbetacellsinneonatalstreptozotocintreatedrats［J］.Diabetes,2004;53(3):608-615. ［3］YamamotoT,AkisueT,MaruiT,etal.Expressionofbetacellulin,heparinbindingepidermalgroanmalignantfibroushistiocytoma［J］.AnticancerRes,2004;24(3b):
8、2007-2010. ［4］LiL,SenoM,YamadaH,etal.Promotionofbetacellregenerationbybetacellulininniypercentpancreatectomizedrats［J］.Endocrinology,2001
