人白细胞介素1受体拮抗基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

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1、人白细胞介素1受体拮抗基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达　　摘要:目的获得一株重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的高效表达菌株，为研究各种急慢性炎症疾病的发病机制以及拮抗IL-1的生物学效应奠定基础.方法分离人外周血淋巴细胞，提取mRNA，反转录PCR获得人白细胞介素1受体拮抗基因（hIL-1ra），克隆入大肠杆菌表达载体，从而构建高效表达人IL-1ra的重组菌株.结果成功构建了IL-1ra的高效表达菌株（pLDH-hIL1ra），序列测定与文献报道一致.12%SDS-PAGE分析显示此菌株所表达的目的蛋白产物相对分子质量为2

2、3ku，与预期结果相符.光密度扫描重组hIL-1ra蛋白质占细菌总蛋白的30%.结论在大肠杆菌中成功地表达了hIL-1ra基因.　　Keyen;receptors，interleukin-1;genes;geneex-pression;Escherichiacoli　　Abstract:AIMToobtainahighexpressioncloneofhumaninterleukin1receptorantagonist（hIL-1ra），portanceinthepathogenesisofbothacuteandchro

3、nicinflammatorydiseasesandapetitiveinhibitorofthebindingofIL-1toIL-1R.METHODSmRNAhumanperipheralbloodmonocytes（PBMC），andthecodingsequenceofhIL-1raplifiedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction.Theexpressionvec-torpLDH-hHIL1raperatureinduction，theIL1-raolecula

4、ranIL-1rahaseffectivelybeenexpressedinE.coli.　　0引言　　人白细胞介素1受体拮抗剂（interleukin-1recep-torantagonist，IL-1ra）是在某些白血病患者血清和尿中以及单核细胞培养上清中发现一种多肽性质的IL-1特异性抑制因子，可由LPS刺激的单核细胞，PMA，PHA，CSF刺激的单核细胞系产生［1］.实验表明，LI-1ra可阻断LPS引起的家兔死亡、减轻免疫复合物所诱导的炎症、抑制小鼠骨髓移植后GVHR的发生、提高存活率、并能防治动物实验性结肠炎［2

5、，3］.在临床上，IL-1ra可用于治疗败血已进入Ⅲ期临床验证）、类风湿关节炎、脓毒症、化脓性休克等［4］;在基础研究中，IL-1ra可以用于研究急慢性炎症的发病机制.因此，利用基因工程技术来生产IL-1ra，无论是在基础研究还是在临床应用均具有重要意义.　　1材料和方法　　1.1材料表达载体pLDH99由本室赵忠良构建（Fig1）;大肠杆菌DH5α由本室保存.正常成人外周血取自赵忠良.PCR引物由Cybersyn公司合成（引物序列为:ATAATGCGACCCTCTGGGA-GAAAATC，CTGGATCCTACTCGTCC

6、TC-CTGGAAG），淋巴细胞分离液（ρ=1.077）购自Sig-ma;polyATractSystem1000mRNA分离试剂盒购自Promega公司;SupercriptIITM反转录试剂盒、限制性内切酶、T4DNAligase等购自GibcoRBL公司，KlenTaq高保真PCR试剂盒购自Clontech公司;QIAEXⅡ凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司.SequenceofsMCSs:102030AGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATT405060TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATA

7、TCGGATC708090CTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCT100110TGGCACTGGCCGTCGTTTTACAGCTT　　图1略　　1.2方法　　1.2.1人IL-1ra基因的克隆正常成人外周血经梯度离心（梯度离心液ρ=1.077）后，收集交界层的PBMC，以Hank’液洗3遍后，以1×106个细胞在含20mgL-1PHA的RPMI-1640培养基中培养，置于37℃，50mLL-1CO2中培养48h后收集细胞，用polyATractSystem1000试剂得到纯化的mRNA，Supercrip

8、tIITM反转录得到cDNA，以此为模板，进行PCR参数为95℃，15s;55℃，30s;72℃，30s，共25个循环.　　　　1.2.2人IL-1ra基因在载体中的定向克隆将表达载体pLDH99用EcoRV与BamHI双酶切，制备成一平一粘的载体片段;同时PCR产物也经BamHI酶切制备