人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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1、人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达【摘要】目的在大肠杆菌中高效表达人核心蛋白聚糖，并建立适当的纯化方法，制备重组蛋白。方法根据GenBank中人核心蛋白聚糖的序列设计特异性引物，从人肝cDNA文库中PCR扩增核心蛋白聚糖的编码序列，克隆到原核表达载体pET42a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，获得以高效表达的目的重组蛋白；用SDSPAGE和质谱鉴定重组蛋白。结果重组蛋白主要以包涵体形式表达，SDSPAGE显示其分子质量与预期结果相符；经质谱鉴定，表达的重组蛋白为人核心蛋白聚糖。结论成功地在大肠杆菌中高效表达了人核心蛋白聚糖，并纯化得

2、到人核心蛋白聚糖蛋白，经鉴定，纯化所得到的蛋白为人核心蛋白聚糖。【关键词】核心蛋白聚糖；原核表达；蛋白纯化；质谱鉴定【Abstract】ObjectiveToexpressthehumandecorininEscherichiacolieffectively,tosetupaappropriateprotocolforpurificationoftherebinantproteinandtopreparetheexpressedhumandecorin.MethodsSpecificprimersforhumandecorinandecorinplifiedfromah

3、umanlivercDNAlibrary,andidofDpET42a.TheplasmidedintoBL21(DE3)strainofE.coli.Afterinductionandecorinandecorinofinclusionbody.IdentificationsbySDSPAGEandmassspectrometrydemonstratedthattherebinantproteinandecorin.ConclusionHumandecorinandecorin.【Keyassspectrometer在传统的烧伤治疗中，深度烧伤不可避免形成病理性瘢

4、痕，由于病理性瘢痕形成机制尚未完全明确，烧伤后增生瘢痕及瘢痕疙瘩成为目前困扰临床治疗日益突出的问题。随着细胞生物学及分子生物学在瘢痕形成机制方面研究的深入，人们发现多种生长因子在瘢痕的形成中起作用，目前研究较多的有转化生长因子β(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)及碱性生长因子(bFGF)，其中TGFβ的作用尤为突出，TGFβ是一种具有多种生物学效应的细胞因子，在损伤修复过程中可诱导纤维黏连蛋白、肌腱蛋白、胶原及蛋白多糖等多种细胞外基质（ECM）的沉积，同时通过降低蛋白酶的合成及提高蛋白酶抑制剂的水平阻止ECM的降解，诱导ECM的沉积，

5、导致瘢痕的形成［1］。体外及动物实验均已证实TGFβ抑制剂——核心蛋白聚糖（Decorin）能与TGFβ结合，中和其活性，从而可以治疗烧伤瘢痕。国内外对治疗用Decorin的研究已做了大量的工作，但仍有许多空白，到目前为止，国内尚未见重组人Decorin的报道。本研究将人Decorin基因在大肠杆菌中高效表达，为生产治疗用Decorin打下基础。1材料和方法1.1材料1.1.1菌种及质粒：人肝cDNA文库，E.coliDH5α、BL21（DE3）及pET42a(+)质粒为本室保存。1.1.2主要试剂及仪器：VentRDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶（B

6、ioLabs公司）；质粒小提、玻璃奶回收试剂盒（博大泰克公司、赛百胜公司）；DNA相对分子质量标准（TaKaRa公司）；其它试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1目的基因的扩增：根据GenBank中人Decorin的基因序列，设计合成一对引物（上海生工生物通讯：李慎涛，Email:lishentaosina.工程技术服务有限公司合成），引物中引入NdeⅠ、HindⅢ酶切位点。扩增编码Decorin的DNA序列。P1：5'GGAATTCCATATGAAGGCCACTATCATCC3'，P2：5'CCCAAGCTTTTACTTATAGTTTCCGAGTT3'，以

7、人肝cDNA文库为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增Decorin全长基因。扩增参数为：94℃预变性5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，32个循环；72℃后延伸10min。电泳观察结果。1.2.3目的基因表达质粒（pET42/D）的构建：将特异的PCR扩增产物经玻璃奶回收纯化。纯化产物与原核表达质粒pET42a(+)分别用NdeⅠ、HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收。经T4DNA连接酶连接过夜，转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB培养板上，37℃培养过夜。挑取单克隆扩增后提取重组质粒进