p6bmp2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

《p6bmp2的克隆及其在大肠杆菌中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、P6BMP2的克隆及其在大肠杆菌中的表达【摘要】目的：在大肠杆菌中克隆和表达骨形态发生蛋白2（BMP2）的变体P6BMP2并初步纯化。方法：根据P6肽的氨基酸序列，按照大肠杆菌偏爱密码子将P6肽的核酸序列设计在5′端引物，通过PCR方法合成P6BMP2基因，并将其克隆到大肠杆菌表达质粒pALEX中，经NcoⅠ、XhoⅠ双酶切和DNA序列测定验证。结果：通过双酶切和DNA序列分析，证实获得的基因片段与我们期望的相符合，重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和HeparinSepharoseTM6FastF

2、loorphogeneficprotEin，BMP)以来，研究者们经过大量动物实验和临床应用研究证实，BMP能在非骨组织如肌肉中诱导形成软骨和骨，是一种高效的骨诱导蛋白，其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导骨形成的因子[2]。由于越来越多的实验证实了BMP2在诱导骨形成和骨修复方面的高效性及安全性，人们开始将其应用于骨科临床，并得到了令人满意的疗效[36]。另一方面,在骨缺损的修复重建过程中，成骨细胞产生的Ⅰ型胶原具有特定的引导骨组织修复再生的生物学特性，在促进成骨细胞的粘附、增殖和分化同时，对破骨细胞的吸收也有一定作用。这些功能据推测

3、与其分子结构中含有特定的细胞识别信号有关[7]，Bhatnagar等[89]发现在Ⅰ型胶原α链中含有有效细胞结合位点，为一段15个氨基酸序列的细胞结合肽，其与ABM(无机骨粒)相结合可模拟骨细胞外基质成分，促进骨再生。Bhatnagar[10]以此为基础,发明了一组用来模拟Ⅰ型胶原蛋白细胞连接域的肽段,IleAla是其核心序列，呈现β弯曲构象。P6肽是其中的一种,其序列是GlnGlyIleAlaGlyGln。周炳荣等[11]的研究显示，P6肽能够刺激人骨髓间充质干细胞的增殖；杨旭东等[12]则将P6肽和无机骨粒复合用来治疗骨缺损

4、，结果显示该复合物具有较强的促进骨缺损修复能力。这些都表明P6肽具有一定的促进间充质干细胞增殖，加快骨组织修复和再生的能力。为了将BMP2和胶原蛋白在引导骨组织修复或再生中的功能结合起来,我们构建了P6BMP2融合蛋白，希望这个融合蛋白可以提高骨形成能力。　　1材料与方法　　1.1材料1.1.1菌株E.coli克隆菌株Top10和表达菌株BL21(DE3)均由本实验室保存。1.1.2基因和质粒pALEX和pCIBMP2由本实验室保存。1.1.3酶及化学试剂各类限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq聚合酶等购自Takara公司；RNasin购自P

5、romega公司；引物片断由上海博彩生物公司合成；柱离心胶回收试剂盒购自华舜公司；HeparinSepharoseTM6FastFloarcia公司；其他化学试剂均为国产分析纯。　　1.2方法1.2.1质粒DNA提取、DNA酶切及连接转化参见参考　　2结果　　2.1PCR获得P6BMP2基因根据已知的人BMP2基因序列，我们设计的5′端引物增加了NcoⅠ位点，并在BMP2编码区的N端增加了一个P6肽的编码区，于3′端引物终止密码子前增加了XhoⅠ位点。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，所得条带与378bp的理论值一致。见图1。1.PCR产物

6、；2.分子质量标准DL2000，从上到下依次是2000、1000、750、500和250bp2.2pALEX/P6BMP2质粒的构建利用T4DNA连接酶连接分别经NcoⅠ和XhoⅠ消化的P6BMP2基因片断与pALEX载体，连接产物转入E.coliTop10克隆菌株，经双酶切鉴定得到含pALEX/P6BMP2的阳性克隆(图2)，对重组质粒pALEX/P6BMP2进行核苷酸序列分析表明，在重组质粒的T7启动子下游插入DNA片断与预期的完全一致。图3为重组表达质粒pALEX/P6BMP2,P6BMP2编码的氨基酸序列如下（方框内为P6肽的氨基酸序列）

7、：MGQGIAGQQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR。1.分子质量标准DL2000，从上到下依次2.3P6BMP2的表达及纯化含有表达质粒pALEX/P6BMP2的BL21(DE3)表达菌株经诱导，收集菌体进行15%的SDSPAGE分析(图4)，在相对分子质量为14000附近出现了表达条带，其分子质量与P6BMP2的理论分子质量相符合。表达产物经纯化后得到纯的P6BMP2（图5）。1.表达菌总蛋白；2.裂解上清；3.细菌裂解沉淀3讨论　　骨形成蛋白是转化生长因子β超家族的成员

8、，属于二硫键交联的生长和分化因子。它是一类具有多种功能的细胞因子家族，一方面，BMP是一种能诱导未分化间充质细胞向骨和软骨发生不可逆转化