人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达论文

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1、人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达论文王利民温铭杰李慎涛【摘要】目的在大肠杆菌中高效表达人核心蛋白聚糖，并建立适当的纯化方法，制备重组蛋白。方法根据GenBank中人核心蛋白聚糖的序列设计特异性引物，从人肝cDNA文库中PCR扩增核心蛋白聚糖的编码序列，克隆到原核表达载体pET42a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，获得以高效表达的目的重组蛋白；用SDSPAGE和质谱鉴定重组蛋白。结果重组蛋白主要以包涵体形式表达.freelandecorininEscherichiacolieffectively,tosetupaappropriateprotocolforp

2、urificationoftherebinantproteinandtopreparetheexpressedhumandecorin.MethodsSpecificprimersforhumandecorinandecorinplifiedfromahumanlivercDNAlibrary,andidofDpET42a.TheplasmidedintoBL21(DE3)strainofE.coli.Afterinductionandecorinandecorinofinclusionbody.IdentificationsbySDSPAGEandmassspectrometrydemo

3、nstratedthattherebinantproteinandecorin.ConclusionHumandecorinandecorin.【Keyassspectrometer在传统的烧伤治疗中，深度烧伤不可避免形成病理性瘢痕，由于病理性瘢痕形成机制尚未完全明确，烧伤后增生瘢痕及瘢痕疙瘩成为目前困扰临床治疗日益突出的问题。随着细胞生物学及分子生物学在瘢痕形成机制方面研究的深入，人们发现多种生长因子在瘢痕的形成中起作用，目前研究较多的有转化生长因子β(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)及碱性生长因子(bFGF)，其中TGFβ的作用尤为突出，TGFβ是一种具

4、有多种生物学效应的细胞因子，在损伤修复过程中可诱导纤维黏连蛋白、肌腱蛋白、胶原及蛋白多糖等多种细胞外基质（ECM）的沉积，同时通过降低蛋白酶的合成及提高蛋白酶抑制剂的水平阻止ECM的降解，诱导ECM的沉积，导致瘢痕的形成［1］。体外及动物实验均已证实TGFβ抑制剂——核心蛋白聚糖（Decorin）能与TGFβ结合，中和其活性，从而可以治疗烧伤瘢痕。国内外对治疗用Decorin的研究已做了大量的工作，但仍有许多空白，到目前为止，国内尚未见重组人Decorin的报道。本研究将人Decorin基因在大肠杆菌中高效表达，为生产治疗用Decorin打下基础。1材料和方法1.1材料1.1.1菌种及质粒

5、：人肝cDNA文库，E.coliDH5α、BL21（DE3）及pET42a(+)质粒为本室保存。1.1.2主要试剂及仪器：VentRDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶（BioLabs公司）；质粒小提、玻璃奶回收试剂盒（博大泰克公司、赛百胜公司）；DNA相对分子质量标准（TaKaRa公司）；其它试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1目的基因的扩增：根据GenBank中人Decorin的基因序列，设计合成一对引物（上海生工生物通讯李慎涛，Email:lishentaosina.工程技术服务有限公司合成），引物中引入NdeⅠ、HindⅢ酶切位点。扩增编码Decorin的DNA序列。P

6、1：5'GGAATTCCATATGAAGGCCACTATCATCC3'，P2：5'CCCAAGCTTTTACTTATAGTTTCCGAGTT3'，以人肝cDNA文库为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增Decorin全长基因。扩增参数为：94℃预变性5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，32个循环；72℃后延伸10min。电泳观察结果。1.2.3目的基因表达质粒（pET42/D）的构建：将特异的PCR扩增产物经玻璃奶回收纯化。纯化产物与原核表达质粒pET42a(+)分别用NdeⅠ、HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收。经T4DNA连接酶连接过夜，转化E.col

7、iDH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB培养板上，37℃培养过夜。挑取单克隆扩增后提取重组质粒进行NdeⅠ、HindⅢ双酶切及PCR电泳鉴定，筛选出的重组质粒进一步测定目的基因的核苷酸序列。1.2.4目的基因的诱导表达：将重组质粒pET42/D转化工程菌E.coliBL21(DE3)，提取质粒、酶切鉴定。挑取单克隆接种于含卡那霉素（50mg/L）的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按2%比例接