醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.doc

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1、浙江工业大学生物与环境工程学院第九届“昂立杯”学生课外学术科技作品竞赛醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达作者：童小龙所在班级：生物工程0803小组成员：林浩、马斌祥指导教师：柳志强2010年11月摘要：本研究根据已知的编码醛缩酶的基因序列，设计一对特异性引物，以实验室保藏菌株ZJUTB-DERA的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到约750bp的片断，将该片断与克隆载体pMD18-T连接并测序，根据测序结果，重新设计一对引物，并在两端加上NcoI和SalI的识别位点序列，通过PCR获得长度为684bp的醛缩酶编码基因，将所得片断定向克隆至pE

2、T28b载体中，转化至BL21感受态细胞中，筛选出了阳性克隆子。利用IPTG对阳性菌进行诱导，并对表达产物进行了分离纯化，SDS-PAGE电泳检测出在约24kD处有一蛋白表达带，对重组基因工程菌的酶进行测定，结果为133.8U。关键词：2-脱氧核糖-5-醛缩酶、基因克隆、表达、酶的纯化引言他汀类药物(Statins)是20世纪80年代后期开发的一种降血脂药物，作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，通过与该酶竞争性结合，使HMG-CoA无法转变成甲羟戊酸(Mevalonate)，甲羟戊酸是合成内源性胆固醇的原料，从而阻断胆固醇

3、的合成，降低血胆固醇的水平。此外，他汀类药物还具有降低甘油三酯、提升高密度脂蛋白水平等重要作用，因此，他汀类药物在预防和治疗冠心病、动脉粥样硬化等方面有着广泛的应用。另外有研究显示，他汀类药物还可以影响肿瘤细胞的生存与发展，具有一定的抗肿瘤作用。据统计数据表明，在调/降血脂药物市场中，他汀类原料药所占的市场份额约为180多亿美元，占全球调/降血脂类药物60%的市场份额。因此，随着部份药物专利到期，各制药企业和相关研究机构积极投身于他汀类药物的生产和研发。目前全球已开发的他汀类药物有十多个品种，如洛伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀等，从各类他汀的化

4、学结构中发现它们普遍都具有一个手性的侧链基团，其结构是二羟基酸或是（杂）环芳香内酯。由于在化学合成该手性侧链的过程存在着成本高、污染严重，反应步骤长，合成收率低，副反应多，产品分离纯化难度大等缺点。同时，随着生物催化与生物转化研究的飞速发展，结合生物酶法与化学法合成他汀侧链逐渐成为研究热点。醛醇缩合反应是碳碳键生成的有效反应之一，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA,EC4.1.2.4)则是不对称直接醛醇缩合反应的高效催化剂，它可以在水溶液中、中性pH条件下催化不对称碳碳键的形成，因此受到研究者的广泛关注。DERA是一种无需磷酰化体的独特的生物催化剂

5、，它可以催化D-甘油醛-3-磷酸与乙醛反应生成2-脱氧-D-核糖-5-磷酸酯。该醛缩酶正在成为强大的用于工业合成手性分子的工具，它可以利用乙醛或和2-取代乙醛为底物，通过4-取代-3-羟基正丁醛中间产物来生产2,4,6-三脱氧己糖或其衍生物。此类2,4,6-三脱氧己糖及其衍生物是他汀侧链的合成前体。与其它酶类相比，DERA合成他汀侧链具有原料结构简单易于检测分析，且来源丰富、价格低廉等优点。目前研究最多的是利用乙醛和氯乙醛反应生产6-氯-2,4,6-三脱氧吡喃糖苷。利用DERA催化的羟醛缩合反应来生产他汀侧链具有一定的不足之处，主要表现为生产能力低，原

6、因是该酶对醛类物质（包括乙醛、氯乙醛等）的耐受性较差，在高浓度底物存在下，醛缩酶极易失活。在研究初期，该反应是在低底物浓度，低温（2-4℃），高酶浓度下，经过7天的反应时间，才达到100g·L-1的产物浓度。本文作者根据NCBI公布的醛缩酶编码基因序列，设计了一对引物，利用实验室保藏菌株ZJUTB-DERA的基因组DN为模板，扩增得到了编码醛缩酶编码的基因序列，并构建了含有编码醛缩酶结构基因的原核表达载体pET28b-DERA，成功地使其在E.coliBL21中进行了活性表达，本文报道有关研究结果。1材料与方法1.1工具酶和试剂基因组提取试剂盒购自MP

7、公司，质粒提取盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自Axygen公司，各种工具酶均购自Takara（宝生物）公司，配制微生物培养基所用酵母粉、蛋白胨为OXOID公司产品。1.2质粒，菌株与培养条件所用克隆载体为pMD18-T，表达载体为pET28b，宿主大肠杆菌为JM109(recA1sμpE44endA1hsdR17gyrA96relA1thi△(Lac—proAB)F’[traD36proAB+lacIqlacZ△M15])和BL21(DE3)(F-，ompT，hsdS(rBB-mB－)，gal，dcm(DE3))，均为本实验室保存。LB培养

8、基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5，pH7.0。需要时使用前加入100μg/m