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时间:2018-09-05
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1、淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达一、相关背景淀粉酶是较早发现的酶类之一,早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillusoryzae)中提取出作为消化剂的酶,即高峰淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。淀粉酶(amylase,AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1,4-葡聚糖,水解α-1,4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类:第一类α-淀粉酶,广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦
2、芽、山萮菜)及微生物。第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键,切下的是麦芽糖单位。第三类葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3),习惯上简称糖化酶,从底物的非还原性末端顺次水解α-1,4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键,切下整个侧枝。还有淀粉α-1,6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称,通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料,由于淀粉酶退浆机械作用小,水的用量少,可以在低温条件下达
3、到退浆效果,具有鲜明的环保特色。除此之外,不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。耐热性α-淀粉酶,由于使用时温度提高,液化完全,用酶量少,操作比较容易,β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。在制醋工业中,常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本,在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。在医药工业上,β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖,医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。二、目前研究情况1.国内外研究机构由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶,国内外很多课题组对它进行了研究。国内主要研究α-淀粉酶的生产菌株及其培养条件;α-
4、淀粉酶的结构以及应用性能,如耐热性、耐酸性;淀粉酶的变性机理以及环境对α-淀粉酶的影响;淀粉酶的固定化和动力性质;对多种α-淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。国外有代表性的研究单位有:加拿大的UniversityofBritishColumbia,他们对人胰腺的α-淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究;丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦α-淀粉酶结构域与结合位点;美国的WestenrRegionalResearchCenter主要研究大麦的α-淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦一淀粉酶的活性位点。2.国内外α-淀粉酶研究方向第一利用传统育种
5、技术对生产菌进行改良;第二对不同来源的α-淀粉酶的基因进行克隆.表达及酶学性质研究;第三α-淀粉酶结构与功能关系的研究。三、实验研究的目标 构建出α-淀粉酶基因,并使其在大肠杆菌(amp+)中进行表达。希望可以通过实验对α-淀粉酶基因的一些功能进行研究。 四、简略研究步骤DNA提取——>(电泳鉴定)——>PCR扩增(引物设计)——>(电泳鉴定)——>电泳——>目标带回收——>(电泳鉴定)——>连接载体(质粒)——>转化大肠杆菌——>菌体PCR检测五、相关实验详细介绍ⅠDNA提取ⅡSDS法提取DNA(一)试剂及器材:1.母液:(1)1MTris-HCl:称T
6、ris-Base12.1g,双蒸水溶解,定容至100ml,用浓HCl调pH8.0(pH8.0)。(2)0.25MEDTA:称Na2EDTA·2H2O9.3g,双蒸水溶解,定容至100ml,用NaOH调pH8.0(pH8.0)。(3)2MNaCl:称NaCl11.6g,双蒸水溶解,定容至100ml。2.SDSbulfer:取母液中1MTris-HCl10ml,0.25MEDTA20ml,2MNaCl25ml,定容至100ml,加SDS2g混合。3.5M醋酸钾:称醋酸钾49g,双蒸水溶解,定容至100ml,乙酸调pH4.8。4.TE:(10mMTris-HCl,
7、0.1mMEDTA)1MTris-HCl1ml,40μlEDTA99ml双蒸水。5.3M醋酸钠(pH5.2):称醋酸钠3H2O40.8g双蒸水溶解定容,固体NaOH调pH至5.2。6.Tris-饱和酚。7.其它:离心机、研钵,7ml离心管,1.5ml离心管,大小枪头,异丙醇,75%乙醇等。(二)步骤:1.取湿菌体约400mg(5ml发醇液),8000rpm,离心5min,弃上清将湿菌体放入研钵中,加液N2(-180℃)约20ml研磨3~5次,2管1.5ml离心管取粉末约0.5ml,各加700μl预热的SDSbuffer,65℃保温1h,7000rpm离心6m
8、in取上清。2.加上清2/3体积(约500μl)的5
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