大肠杆菌-枯杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因表达中的应用

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1、生物技术通报·研究报告·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2013年第9期大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因表达中的应用1，21，21，2111，2杨键 游志庆 麦志茂 李洁 田新朋 张偲（1.中国科学院南海海洋研究所中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广州510301；2.中国科学院研究生院，北京100049）摘要：利用基因重组技术，以枯草杆菌表达载体pWB980为骨架，插入大肠杆菌的克隆载体pUC18中的抗性基因和复制子，构建穿梭质粒pY980coli。将海洋细菌蛋白酶基因hspa插入pY980coli载体P43启动子下游，导入枯草杆

2、菌WB600中，可实现活性表达。关键词：穿梭载体P43启动子枯草芽孢杆菌表达系统蛋白酶分泌表达ConstructionofaVersatileEscherichiacoli-BacillussubtilisShuttleVectorandItsApplicationinProteaseGeneExpression1，21，21，2111，2YangJianYouZhiqingMaiZhimaoLiJieTianXinpengZhangSi（1.KeyLaboratoryofMarineBio-resourcesSustainableUtilization，SouthC

3、hinaSeaInstituteofOceanology，ChineseAcademyofSciences，Guangzhou510301；2.GraduateUniversityoftheChineseAcademyofSciences，Beijing100049）Abstract: AversatileEscherichiacoli-BacillussubtilisshuttlevectorpY980coliwasconstructedbygeneticrecombination.ResistancegeneandrepliconofpUC18,acloningv

4、ectorforEscherichiacoli,wereintegtatedintotheBacillussubtilisexpressionplasmidpWB980.ProteasegenehspafromamarinebacteriumwastheninsertedunderP43promoterofpY980coli,andtherecombinantvectorwastransformedintoBacillussubtilisWB600.Proteaseactivitywasdetectedinthefermentationbroth.Keywords: 

5、ShuttlevectorP43promoterBacillussubtilisexpressionsystemProteaseSecretoryexpression枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，细胞壁不含梭载体会使其更易于操作。内毒素，是一些重要工业酶制剂的生产菌。作为表蛋白酶HSPA是来自海洋细菌Halobacillussp.达系统，枯草芽孢杆菌因其不含内毒素、高效的分SCSIO20089的Thermolysin家族的金属蛋白酶，泌能力、易于高密度发酵等优势被广泛研究。枯草HSPA具有与所在家族其他成员相区别的适冷特［1］杆菌表达载体pWB980是Wu等于1999

6、年基于［5］性。本课题组前期成功获得编码该酶的全长基因pUB110改造构建而得，该质粒具有P43强组成型启（GenBank登录号JX235368），并将其导入大肠杆菌动子和改造了的果聚糖蔗糖酶信号肽，在枯草杆菌中表达，但无法获得有活性的蛋白。考虑到大肠杆中复制赋予宿主卡那霉素抗性，该载体自构建后被［2-4］菌与Halobacillus属进化距离较远，可能无法提供成功应用于多种功能基因的分泌表达。pWB980没有大肠杆菌复制子，因而外源基因克隆操作只能HSPA蛋白加工成熟的内环境，因而本研究尝试将在枯草杆菌中进行。而枯草杆菌的转化步骤繁琐，该基因导入亲缘关系较近的枯草芽

7、孢杆菌中，期望且转化效率相对较低，构建大肠杆菌-枯草杆菌的穿能实现活性表达。收稿日期：2013-03-22基金项目：国家“973”计划项目（2010CB833804），国家“863”计划项目（2012AA092104），海洋公益性行业科研专项（201305018）作者简介：杨键，男，博士研究生，研究方向：海洋微生物酶工程；E-mail：yangjian@scsio.ac.cn通讯作者：张偲，男，研究员，博士生导师，研究方向：海洋生物学；E-mail：zhsmid@scsio.ac.cn2013年第9期杨键等：大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白