大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在mkn45细胞中的表达论文

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1、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在MKN45细胞中的表达论文【关键词】大肠杆菌ConstructionofEukaryoticExpressionVectorContainingE.coliPurineNucleosidePhosphorylaseandItsExpressioninMKN45CellsAbstract：ObjectiveTocloneE.coliPNPgene,constructitseukaryoticexpressionvectorandobtainposi

2、tiveMKN45cellclonesexpressingE.coliPNPgenestably.MethodsPCRamplificationedusingprimersbasedonE.coliPNPgenesequencefromGenbank,E.coligenomicDNAastemplate.PCRproducted,thegeneidinmethod.ResultsPCRyieldedafragmentof716bpandEPNPedigestionanalysisshoountsof

3、EPNPmRNAandshoidcontainingE.coliPNPgene.KeyRNA，前体药MePdR对转染EPNP的MKN45细胞有较强的细胞毒作用。结论成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体,获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。关键词：大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶;自杀基因；基因治疗0引言随着现代生物技术的发展,基因治疗已成为继肿瘤的手术治疗和放疗、化疗后的又一新途径。特别是自杀基因治疗为目前国内

4、外研究的热点之一。大肠杆菌DeoD基因编码的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能将无毒的前体药脱氧腺苷类似物分解产生剧毒的腺嘌呤类似物,通过抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,而引起细胞死亡。同时它能够通过产生极强的旁观者效应,不仅使转基因细胞被杀死,.freelHI和HindIII、T4DNA链接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000Marker均购自大连宝生物公司；凝胶DNA提取Kit和PCR产物纯化Kit购自Promega公司；LipofectaminTMReagent、Geicin(G418Sulfate

5、)及MePdR为Invitrogen公司产品；IPTG和Xgal购自上海生物工程公司。实验所用试剂均为进口或国产分析纯试剂。1.3目的基因的克隆①引物设计:根据GenBank数据库提供的EPNP基因的核苷酸序列设计一对引物。为方便克隆,在上游引物和下游引物的5′端分别引入HindIII和BamHI酶切位点。上游引物：5’–ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：5ATATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取:大肠杆菌JM109基因

6、组DNA的提取,按文献3方法进行。③PCR:94℃变性5min进入循环,94℃,60秒,56℃,60秒,72℃,120秒,经30个循环扩增后72℃延伸10min。取10μlPCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。PCR产物的回收按PCR产物纯化Kit上的说明进行。回收产物保存于20℃备用。1.4PCR产物的克隆及测序TA克隆载体pMD18T与胶回收纯化的PCR产物按1∶3(摩尔比)的比例在T4DNA连接酶作用下进行连接,16℃反应16ｈ。取10μｌ连接反应液转化JM109感受态细菌,将转化

7、的菌液涂在Xgal处理过的含有氨苄青霉素的LB平板上培养12ｈ,在长出蓝、白克隆的LB平板上挑取白色克隆进行少量扩增、质粒小提,用酶切初步鉴定阳性细菌克隆,将酶切鉴定正确的细菌克隆送交大连宝生物公司测序。1.5真核表达载体pcDNA3.1EPNP的构建和鉴定测序正确的质粒pMD18T用限制酶HindIII和BamHI进行双酶切反应,纯化回收约716ｂp大小的目的片段;质粒pcDNA3.1也进行HindIII和BamHI双酶切,纯化回收大片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和线性化的空质粒pcDN

8、A3.1,16℃反应16ｈ。转化感受态细菌JM109,将转化的菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上培养12ｈ,挑取6个阳性克隆进行少量扩增、质粒小抽,以HindIII和BamHI双酶切鉴定阳性细菌克隆。1.6真核表达载体pcDNA3.1EPNP的转染将重组质粒pcDNA3.1EPNP转化的感受态细菌JM109及以空载体pcDNA3.1转化的菌株,在LB培养基中于37℃培养18ｈ,按照质粒提取说明分别提取pcDNA3.1EPNP和pcDNA3.1,经紫