apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

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1、Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达【摘要】　　目的构建Apoptin的原核表达载体，并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法在获得Apoptin融合基因的基础上，成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin，将该质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)受体菌中，以IPTG对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)经

2、IPTG诱导后，经SDS-PAGE分析，在相对分子质量约17000的位置出现目的蛋白条带，大小与Apoptin融合蛋白一致。结论Apoptin原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白，为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。【关键词】Apoptin原核表达载体pET-28a(+)大肠杆菌　　ABSTRACT:ObjectiveToconstructanApoptinprokaryoticvector,aimingtoproducea

3、ntigenicfusionproteinApoptin.MethodsTheApoptingeneplifiedfromthetemplateofplasmidpSSCHG/NT4-Apoptin-HA2-TATbyPCR.TheApoptinultipleclonesitesofplasmidpET-28a(+)togettheprokaryoticvectorofpET-28a(+)-Apoptin,edintoE.coliBL21(DE3).ExpressionofE.coliBL21(

4、DE3)edbypET-28a(+)-Apoptinafterinductionoleculariavirus,CAV)的vp3基因编码的蛋白质，体外合成或基因工程表达的Apoptin能特异的引起多种人源性恶性肿瘤细胞凋亡，对正常二倍体体细胞无作用；且这种选择性凋亡作用既不依赖于p53的介导，也不被bcl-2过表达所抑制［1］，显示其可能在肿瘤基因治疗中具有迷人的应用前景。本实验在获得CAVApoptin基因的基础上，构建Apoptin的原核表达载体(图1)，为下一步表达特异性蛋白产物、制备Ap

5、optin抗体奠定基础［2］。　　1材料与方法　　1.1质粒、菌株、工具酶及试剂　　含Apoptin全基因组序列的体外克隆NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒由本课题组构建［2］；大肠杆菌Top10、大肠杆菌BL21均来自西安华广生物工程公司；质粒pGEM-TEasy购自Promega公司；质粒pET-28a(+)购自Novegen公司；限制性内切酶、Taq聚合酶购自华美生物公司；T4DNA连接酶购自MBI公司；主要试剂为国产或进口分析纯。　　1.2引物的设计和合成　　根据前期研

6、究的Apoptin基因序列的结果［2］，按照载体上正确的插入方向和译读框架设计一对引物。引物的5′端分别添加了限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列。扩增的片段包括Apoptin完整的基因序列。上游引物：5′-GGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3′；下游引物：5′-GCTCGAGTCACAGTCTTATACGCCTTCTTG-3′(下划线处分别为EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列)，由上海生工生物工程公司负责合成，用PAGE纯化。　　1.3目的基因的扩增和纯化　　以含有Apo

7、ptin全基因组序列的pSSCHG/NT4-Apoptin-HA2-TAT为模板，上下游引物各50pmol，10×PCR反应缓冲液10μL，10mmol/LdNTPs2μL，加超净水至终体积为49μL。94℃预变性5min、94℃变性1min、50℃退火1min后，再加入1μLTaqDNA聚合酶。进行94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸1.5min30个循环，72℃继续延伸5min。经酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%(体积分数)乙醇洗涤沉淀后用30μLTE充分溶解沉淀。取少量PC

8、R产物进行10g/L的琼脂糖凝胶电泳，并在紫外线测定A260值对产物进行定量。　　1.4重组质粒pGEM-TEasy/Apoptin(pT/Apoptin)的构建与鉴定　　取上述PCR产物600ng(0.2g/L)、质粒pGEM-TEasy25ng(50g/L)、T4DNA连接酶5u(5u/μL)、10×T4DNA连接酶缓冲液2.5μL以及去离子水18μL(总体积25μL)建立连接反应体系，23℃水浴1h。取10μL连接产物转化100μL感受态大肠杆菌Top10，涂布LB(Amp+)平皿，37℃