人去乙酰化酶sirt1的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

《人去乙酰化酶sirt1的基因克隆及在大肠杆菌中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterCloningandExpressionofHumanSIRT1ByWenleiLVSupervisor：Prof．HongminLiuMicrobialandBiochemicalPharmacySch001ofPharmaceuticalSciencesMay2014学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研

2、成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：昌乏暂13菇1．铀f函年矿‘月们日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单

3、位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：马之葛日期：铀’弘年96月伽日摘要Sirtuin家族在生命体中广泛存在，是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的III类组蛋白去乙酰化酶，迄今为止在哺乳动物中发现的sirtuin家族成员有SIRTl。SRT7，其中对SⅡ汀1的研究最为广泛。在SⅡ汀1介导的去乙酰化反应中，NAD+以共同底物的角色参与反应，该反应过程主要是在SIRTl的催化作用下将作用底物中的乙酰基转移到NAD+的ADP核糖基上，最终产物包括去乙酰化后的SIRTl底物，以及烟酰胺(NAM)和O．乙酰基．ADP．核糖。SIRTl的作用底物

4、不仅有组蛋白底物，还有一部分非组蛋白底物，通过对这些底物的去乙酰化作用，SIRTl参与调控了机体的众多生理过程，例如细胞的凋亡、分化以及衰老，基因的表达调控、能量代谢等。同时S取T1与肿瘤的发生发展有着重要的联系，但是其主要的作用仍存在着争议，这主要是因为在癌症中SIRTl究竟扮演着促癌因子还是抑癌因子的角色尚不能成定论，且在不同的肿瘤组织中其表达水平不够统一。尽管如此，SIRTl作为一个潜在的药物靶点，已经得到了越来越多的科学家的关注。本实验室拟采用基因工程的方法制备具有高生物活性和特异性的SIRTl重组蛋白，并对体外筛选SIRTl激动剂与抑制剂奠定了物质

5、基础。根据文献调研对人SIRTl蛋白选取其193．747位氨基酸片段作为活性片段，因所得cDNA的不正确性，采用OverlapPCR的方法对其进行了定点突变，获得了序列完全正确的活性片段，并将该片段克隆于pGEM．TEasy克隆载体中。鉴定正确之后，将正确的活性片段的基因片段连接入表达载体pET28b中，构建了重组表达载体pET28b／SIRTl。将得到的重组表达载体pET28b／SIRTl转化至E．eoliBL21(DE3)，加入IPTG后进行诱导表达。提取蛋白后，经镍柱亲和层析纯化后得到目的蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET28b／SIRTl，并用该

6、质粒转化F．．coliBL21(DE3)。重组蛋白以可溶蛋白形式表达，确定诱导表达的条件为：重组表达宿主菌37℃振摇培养至OD600约为0．8时加入终浓度为O．5mM的IPTG，20℃培养过夜。纯化后可以得到电泳纯度大于90％的重组蛋白。最后采用荧光定量比色法对纯化后的重组蛋白进行了活性检测，选用共价偶联的短肽Ac-Arg-His-Lys-Lys(Ac)-AMC作为SIRTl的去乙酰化底物，最终结果显示未摘要加底物组与加底物组的荧光值存在明显的差异，证明该重组人SIRTl蛋白在外具有稳定的去乙酰化作用。且该活性检测法可以作为SIRTl抑制剂与激活剂的筛选模型

7、。关键词；组蛋白去乙酰化酶，SIRTl，重组蛋白ⅡAbstractTheSirminfamilyiswidespreadinlivingorganisms，andisaclassIIIhistonedeacet5rlasethatisdependemednicotinamideadeninedinulcleotideNAD+，therearesevenmemnersinsirtuinfamilythatwerefoundSOfarinMammalSIl{T1～SIRT7，andSIRTI(Silentmatingtypeinformationregulati

8、on2homolog1)hasbeenresearc