大豆天冬酰胺合成酶B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达-论文.pdf

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1、第44卷第7期东北农业大学学报44(7)：17-212013年7月JournalofNortheastAgriculturalUniversityJuly2013网络出版时间2013—7—1118：46：00[URL]http：／／www．cnki．net／kcms／detail／23．1391．S．20130711．1846．014．html大豆天冬酰胺合成酶j!}基因的克隆及在大肠杆菌中的表达张继，王相晶，于丹，王晴，向文胜(1．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030；2．黑龙江农业职业技术学院，黑龙江佳木斯154007

2、)摘要：根据GenBank登陆大豆天冬酰胺合成酶(AS—B)基因序列(登录号：GMU55874)设计特异引物，通过PCR扩增从大豆(Glycinemax)cDNA中克隆出Js—基因。将该基因克隆到pET30a(+)载体，构建重组表达栽体pET30a—AS，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS，并进行表达条件优化。结果表明，在16℃条件下，经0．5mmol·L-IPTG诱导14h，大部分重组AS—B以可溶性蛋白的形式存在。经Ni—NTA亲和层析和SephadexG50脱盐后，重组蛋白产率为23．4mg·L-，纯度>90％，

3、以L_谷氨酰胺和NH4Cl为氮源供体时，其比活力分别为2．32和2．60p~mol·min-·mg-。研究结果为研究大豆As—B结构与功能和酶催化动力学机制及建立AS—B抑制剂的高通量筛选平台奠定基础。关键词：天冬酰胺合成酶B；克隆；表达中图分类号：Q786文献标志码：A文章编号：1005—9369(2013)07—0017—05张继，王相晶，于丹，等．大豆天冬酰胺合成酶B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达【J】_东北农业大学学报，2013，44(7)：17—21．ZhangJi，WangXiangjing，YuDan，eta1．Cl

4、oneofsoybeanasparaginesynthetaseBgeneanditsexpressioninE．cohlJ】JoumalofNo~heastAgriculturalUniversitY,2013，44(7)：17-21．(inChinesewithEnglishabstract)CloneofsoybeanasparaginesynthetaseBgeneanditsexpressioninE．coli／zHANGJi’，WANGXiangjing’，YUDan，WANGQing’，XIANGWensheng’(

5、1．SchoolofLifeSciences，NortheastAgdculturalUniversity,Harbin150030，China；2．HeilongjiangAgriculturalVocationalandTechnicalCollege，JiamusiHeilongjiang154007，China)Abstract：Accordingtothesequenceofasparaginesynthetase(AS—B)geneinsoybean(GenBankaccessionnumber：GMU55874)．a

6、pairofspecificprimerswasdesignedtoobtaintheAS—BgenefromGlycinemaxbyPCRamplificationusingcDNAastemplate．ThegeneofAS—BwasthenclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET30a(+)，constructingarecombinantexpressionvectorpET30a．AS，whichwasintroducedintoEco／／RoseRa(DE3)pLysS．Afte

7、rtheoptimizationofinducedconditions，recombinantAS—BwasexpressedinasolubleformwhenthehostharbonngpET30aASwasculturedat16oCandinducedby0．5mmO卜IPTGf0r14h．TherecombinantAS．BwaspunfiedbyNi—NTAaffinitychromato—graphyandSephadexG50chromatographytogiveayieldof23．4mg·’andapudt

8、yof>90％．ThespecificactivityofrecombinantAS-Bwasmeasuredtobe2．32and2．60pmol·min～·mg’’usingL-glutamineandNH4CIasnitrogendonor，