资源描述：
《人白细胞介素11基因在大肠杆菌中的克隆与表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中旧种爹辑第!∀卷第#期∃%&∋(%∋&(%】&&()∃∗+∗,−.∀年#月人白细胞介素−基因在大肠杆菌中的克隆与表达/苗继红王嘉玺彭善云唐佩弦邹民吉段聚宝赵春文马贤凯军事医学科学院基础医学研究所,北京−田0∀1一−的基因摘要将部分缺失的人白细胞介素−伍&2片段缺少编码信号肤及成熟蛋白前&,0个氨基酸的核普酸序列克隆到大肠杆菌高效表达载体3∋45经限制性内切酶及(),,3∋−一278重6序列分析鉴定证实获得了阳性重组克隆命名为45,,组子转化相应的受体菌通过温度诱导得到了表达产物∀−∃聚丙烯酞胺凝胶电泳,8∋2一∃6∃一
2、)9检测表明在大肠杆菌中:&−的表达量占菌体总蛋白的∀1;左右一+基因3∋一:&2片段在45−载体中所表达的蛋白融合了<∃=聚合酶(端.个氨,主要以,,基酸包涵体形式存在用尿素提取包涵体得到的重组蛋白纯度可达01;以8,一上用&2荀依赖细胞株>刀〕−及
3、&−#∀的增殖刺激?细胞依赖的产生免疫球蛋白的细胞发育7Δ,而且,与&2一协同作用促进小鼠及人巨核细胞的形成与成熟,促进原始祖细胞的增殖曰8一,,&2−还能够在体外刺激多时相红细胞生成作用冈诱导肝脏中急性期蛋白的分泌阎可能作为脂肪生成的拮抗物以旁分泌方式,作用于造血微环境网8:几一−Ε6()核昔酸序列含有∀.>个核昔酸的单一的长开放阅读框架,预期编码−.个氨基酸的多肤,其前!−个氨基酸为信号,82一肤成熟蛋白为−>0个氨基酸的活性蛋白:7−成熟蛋白的氨基酸序列中缺少连接糖侧链8ΦΓΓ,,的天冬酞胺一致序列),+4一:Η得∗Η因此表达
4、的蛋白缺少异质性Ι7Δ一,自−..1年&2ϑ分子克隆成功之后白细胞介素−的基因结构及其生物学功能也得到了8,,8阐明由于天然一+的来源有限&2产量不高因此难于满足研究与应用的需要国外报道了,一一Ι7Δ,一在哺乳动物细胞ΕΚ−中成功地表达了有活性的<2−但尚未见到关于:72ϑ在大肠杆菌80个氨基酸的核昔酸序列的:Λ2一中表达的报道本文选择了缺少编码信号肤及成熟蛋白前−一一,一一−卯5−1!#收稿−..魂1∀!1收修改稿/联系人第二#期苗继红等人白细胞介素+基因在大肠杆菌中的克隆与表达基因片段,3∋45&,得到了高效表达的<一ϑ重组蛋白8
5、将其克隆到大肠杆菌高效表达载体2−材料和方法27材料888,,,,−∋ΜΝΝ&∗一,ΠΓ一−−受体菌ΕΚ7印40∀>基因型为Ο3∋ΘΘ:,ΡΝ∀−Θ而丽ΗΓ−Θ,,,Η3,2!1记该菌株带有3Ρ0∀>质粒3Ρ0∀>质粒含入ΡΣ,0∀>基因及卡那霉素抗性基因是8,3∋45−质粒的相容质粒本室保存一一,ΠΦ−88!质粒3?6&细胞由第四军医大学金伯泉教授惠赠888,,,Γ,,,Κ−−Θ酶和主要生化试剂限制性
6、内切酶Γ7刀ϑ7Χ77∋ΕΚΝ&∃Ε7∃7Ω,Σ77等ΒΓΤ:购自Κ+77Χ∗7,Γς∋8,?Θ6()连ΩΗΚΒ∗ΧΓ∗:<+:∗而公司ΕΚ7Μ6()聚合酶&大片段接酶购自公司ς测序试剂盒购自≅+ΜΣ∗Ρ∃ΣΓΣ∗,ΜΚΕ:ΕΓ7公司8洲刁弓88,Θ!方法、、、、、Ξ基因重组质粒6()的提取纯化酶切片段回收连接转化均参照文献门方法进行88,Γ,一−!8!核酸序列测定采用∃+Χ∗Η的末端终止法和<∗,Μ+Χ的<−5克隆模板系统在2Ψ公司产!1−1型6()测序仪上进行核酸序列测定8−8!53∋−一7重∋8ΕΚ7Μ外源基因在大肠杆菌
7、中的表达4527组质粒转化ΝΝ&中Ρ0∀>获一,,,得表达:&2−重组蛋白的菌株表达菌于51℃活化过夜−Ξ−1稀释于2培养液中于51℃振8,,。摇培养至Ζ68朋约为18#转至Θ!℃继续培养Θ一,:Θ!℃灭活Ε&0∀>对Ω启动子的阻遏作8,一用使:&2−基因得到表达−Θ∃Φ3)9∋?ΗΜ∃义孤[2一−进行∃一)988!6∃采用缓冲液系统对重组:&6∃∋分离胶浓度为−!;积层胶为,,,∀;电泳条件为−1Β)恒流−Θ:电泳凝胶用考马斯亮蓝Ν!∀1染色用双波长扫描仪%∃一−1对染色的湿凝胶进行扫描8一Η+−8!∀包涵体蛋白的回收及蛋白提取发
8、酵的高效表达:&2−的大肠杆菌液经Θ11Α而离心收菌,用?∋缓冲液∀1−瓜?ΗΜ,一,−7压∋6?),3ϑ∃8∀洗涤,用超声方法破%7菌,离心沉淀,收集包涵体∴,用7压尿素清∴洗沉淀以除去菌体杂蛋白,ΘΒ
