木糖还原酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达.pdf

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1、CloningofxylosereductasegenefromPichiastipitisandexpressioninSnCcharomyceScerevisiaebyMAHuimingAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofSciencelnBiochemistry&MolecularBiologylnCentralSouthUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChang

2、shaHunan410004，P．R．CHINASupervisorProfessorChenJienanandHeGangApril，2011』恻愀磐必中南林业科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。)．r．作者签名：知隧吲为ff年6月]日中南林业科技大学学位论

3、文版权使用授权书：麓辑¨啦琶秀澎毛／日作者签名：倦嘲黝签名：所钐々加11年名月]日2彦／／年勿月日摘要木糖是植物木质纤维素的重要组成部分，木糖的发酵在生物质转化燃料乙醇中非常重要。传统乙醇生产菌株酿酒酵母只能利用葡萄糖，而不能利用木糖发酵，但能发酵其异构体木酮糖，可通过基因工程的方法将代谢木糖的关键基因转入酿酒酵母，对其进行改造以获得能利用木质纤维素水解液中的多种组分又能稳定高效产乙醇的基因工程菌。因此本研究主要目的是从发酵木糖的高效菌株树干毕赤酵母中获得发酵乙醇的第一个关键基因木糖还原酶基因，并将其转化酿酒酵母，为后续发酵木糖产乙醇基因工程菌的构建奠定基础。本研究以树干毕赤酵母(Pic

4、hiastipit&)CBS6054为基因供体菌，依据其在NCBI中公布的木糖还原酶基因序列设计特异引物，采用PCR的方法克隆到木糖还原酶基因序列，测序结果表明所得序列无碱基突变。将基因克隆到带有强启动子GPD的穿梭表达载体p424GPD中，并将载体p424GPD-xyll转化大肠杆菌，通过超声破碎方法提取大肠杆菌总蛋白，SDS．PAGE电泳分析总蛋白，测定木糖还原酶酶活，验证载体构建成功，表达载体的成功构建为后续利用木糖发酵重组酿酒酵母的构建奠定基础。将构建好的表达载体线性化处理后转化酿酒酵母单倍体，通过营养缺陷型和PCR检测进行筛选。将筛选出的阳性重组子进行培养，测定酶活，重组191

5、6和1917的酶活测定结果在0．1．O．3U／mg左右。将酶活最高的重组单倍体酵母1916—8与1917．1进行结合，根据子囊孢子染色筛选二倍体，测定二倍体酶活，酶活结果在0．1U／mg左右，相比较单倍体酿酒酵母木糖还原酶基因的表达量，二倍体酿酒酵母酶活较低，没有达到预理想结果。将表达载体导入酵母中表达，酵母经过若干代繁殖后，质粒容易丢失，所以构建了酵母整合载体。将表达载体上的调控元件和木糖还原酶基因通过酶切酶连方法连接到整合载体上，其后通过将整合载体将木糖还原酶基因整合到酵母染色体上，使之成为酵母染色体DNA的一部分，增强其遗传稳定性，从而使其在酿酒酵母中高效稳定的表达，为构建高效稳定

6、发酵木糖的酵母基因工程菌构建奠定基础。关键词：树干毕赤酵母；酿酒酵母；木糖还原酶；表达载体；整合载体ABSTRACTXyloseisoneofthemajorcomponentsincellulosicbiomass，andthefermentationofxyloseiSessentialforthebioconversionofbiomasstoethan01．ThecommonlyusedSaccharomycescerevisiaehasmanyadvantagesasanethanolproducer，suchasfastD—glucoseconsumption．However

7、,amajordrawbackisthatS．cerevisiaecannotutilizethepentosesugarxylose，onlyutilizingitsisomerxylulose．wecanattempttocloneandtransformthekeygeneencodingenzymesfortheconversionofxylosetoxyluloseinS．cerevisiaetogainthegeneen