嗜麦芽窄食单孢菌（s.maltophilia）0450基因组文库构建及脂肪酶基因克隆和表达

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1、摘要从湖北武汉、襄樊等地的油料厂和屠宰场采集到200余份土样。经以橄榄油为底物的富集培养、平板初筛和摇瓶复筛，选定71株脂肪酶活性较高的菌株。经过形态观察、生理生化特性及16SrRNA基因序列分析后，将其中一株菌株鉴定为嗜麦芽窄食单孢菌(StenotrophomonasmaltophiliaBradburyJF)，命名为S.maltophilia0450。该菌株所产脂肪酶的最适反应温度为45℃，最适pH值为9.0。在pH7.0-10.0范围内2+2+2+活性稳定，并具有一定的热稳定性。5mmo1/L的Ca对酶有激活作用，Fe和Mn对酶有抑制作用。S.maltophilia0450基因组DNA经

2、Sau3AI部分酶解后，以pHBM803为载体，E.coliXL-Glod10为宿主，构建了该菌株的基因组文库，并从中筛选得到一个能分解橄榄油底物的阳性克隆子。经测序，该阳性克隆子的插入片段含有大小为1.2kb的基因，编码框(ORF)大小为1101bp，编码一个含365个氨基酸的蛋白质，该蛋白质含有一个-G-X1-S-X2-G-脂肪酶保守五肽区域。将获得的目的基因克隆到pET28a(+)表达载体上，在E.coliDH5α进行表达，经IPTG诱导，摇瓶发酵、超声波破碎细胞后，利用NaOH滴定法测定脂肪酶活力为7.75U/mL，检测到脂肪酶的水解活性。通过SDS-PAGE凝胶电泳，表达得到的目的蛋

3、白分子量大小为39kDa左右。由此，确证克隆到的基因是脂肪酶基因。该基因在GeneBank的序列登录号为：DQ647508。关键词：脂肪酶嗜麦芽窄食单孢菌0450基因组文库基因克隆与表达IAbstractSeventy-onelipase-producingbacterialstrainswereisolatedfromoil-stainedsoilsamplesbysolidplatemethod,amongwhichonestrainwasidentifiedasStenotrophomonasmaltophiliabyitsmorphological,biochemical,physio

4、logicalnaturesandmatchingof16SrRNAgenesequence,andnamedasS.maltophilia0450.Byfurtherexperiments,theoptimalconditionsforlipaseactivityarepH9.0and45℃.2+2+2+Thelipasecanbeactivatedby5mmo1/LCa,butinhibitedbyFeandMn.Italsoexhibitsfairlyhighthermo-stabilityfrompH7.0topH10.0.ThegenomiclibarayofS.maltophili

5、a0450wasconstructedbypHBM803andE.coliXL10-Goldsystem.AfterRodaminB+oliveoilcheck,thepositivecloneps01wasselectedandsequenced.Thelengthofinsertedfragmentis1.2kb,containingawholeORFat1101bpsandcodingaconservedhypotheticalproteinof365aminoacids.Theproteinhasaconservativedomainof-G-X1-S-X2-G-asinanyothe

6、rlipase.LigatedthegenewithpET28a(+)andexpressedinE.coliDH5bytheinductionofIPTG,hydrolysisoftheobtainedproteinasalipasewasdetectedanditsmolecularmasswasmeasuredas39KDabySDS-PAGEmethod.Fromtheabovetestednatures,weconfirmthatwehaveclonedthelipasegeneofS.maltophilia0450whichdepositedinGenBankwiththeacce

7、ssionnumberDQ647508.Keywords：LipaseStenotrophomonasmaltophilia0450GenomiclibrariesGenecloneandexpressionII独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文