嗜麦芽黄单胞菌cg样受体及xcg蛋白基因的研究——嗜麦芽黄单胞菌cg样受体跨膜域克隆，基因组文库构建筛选及xcg蛋白基因多型性分析

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1、博士学位论文抽。要嗜麦芽黄单胞菌cG样受体及xCG蛋白的基因研究——嗜麦芽黄单胞菌CG样受体跨膜域的克隆．基因组文库的构建筛选及xCG蛋白的基因多型性分析媾士生：梁淑芳导师：陈曼玲教授摘要：嗜麦芽黄单胞菌(XanthomonasmaltophiliaATCCl3637)属于G一，既具有类似哺乳动物调节妊娠与生殖的LH／CG(黄体生成素／绒毛膜促往腺激素)受体的cG类受体蛋白(CG—likereceptOF)，又能分泌分子量为48．5KD、与hCG分子B链有一定同源性的xCG蛋白。』maltophilia是第一个发现既具有内源性配基(xC

2、G蛋白)，又具有受体(cG样受体)的原核生物。J册aJtophiliaCG样受体在蛋白质分子量、配基结合特性等方面与大鼠LR／CG受体有一定的相似性，至今对该菌cG样受体的基因、结构与功能均不清楚。为了进一步了解嗜麦芽黄单胞菌cG样受体的生物学功能，深入研究其结构，需从分子水平研究编码cG样受体的基因及其结构特点，并与哺乳类LH／CG受体基因及其蛋臼序列进行比对分析。这对于探讨原核生物CG样受体与真核生物LH／CG受体是否存在共源性，以及该菌的致病机制均有重要意义。博士掌位论文摘要首先，鉴定确证菌种XmaltophiliaATCCl36

3、37属于嗜麦芽黄单胞菌；并建立了一种快速简便提取嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA的方法，即用去污剂SDS和CTAB破坏细胞膜结构，使胞内核酸释放，用酚／氯仿／异戊醇去除CTAB／多聚糖／蛋白质复合物，异丙醇沉淀DNA，TE溶解DNA。该方法简便快速，节省实验试剂和时间；所提取的DNA纯度和浓度均较好，为进一步酶切分析、PCR操作及构建基因组文库提供了良好的实验材料。其次，根据已知生物LH／CG受体同源性较大的跨膜域序列设计了一对引物，以嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，约600bp目的PCR产物克隆到pUCm，T载体上，经酶切及

4、PCR扩增鉴定，获得重组质粒pUCm．Rec。以DIG标记的PCR扩增片段作为探针进行DNA斑点杂交，探针与Xbal消化的重组质粒(pUCm-Rec)DNA和嗜麦芽黄单胞菌染色体DNA有阳性杂交信号，说明约600bpPCR扩增片段与嗜麦芽黄单胞菌染色体DNA有同源性，是以嗜麦芽黄单胞菌染色体DNA为模板的扩增结果。重组质粒pUCm—Rec测序分析表明，593bpCG样受体跨膜域的核酸序列及其推定编码的197aa序列，分别与哺乳类LH／CG受体跨膜域相应区域的碱基序列和氨基酸序列无同源性。推定编码197am跨膜域序列的5～l96aa部分与

5、新月柄杆菌CBl5572aa功能未知的推定蛋白的199～388aa序列具有51％相同序列；其l6～76aa部分与线虫鸟苷酸环化酶的985～1046aa部分具有33％相同2博士掌位论文摘要序列，提示嗜麦芽黄单胞菌可能具有类似鸟苷酸环化酶／cGMP信号系统，为进一步研究其信号转导机制提供线索。第三，自行构建了嗜麦芽黄单胞菌基因组文库，并对文库进行了筛选。嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA分别用妇“3AI和PstI进行不完全酶解后，凝胶电泳分别回收纯化l～5kb和0．5～7kbDNA片段；分别用如删I和一fI消化载体pUCl8后进行去磷酸化处理，再分

6、别与DNA／如u3AI和ONA／PstI回收片段连接，转化感受态JMl09，各得到4200个左右白色转化子，转化平板上白色菌落与蓝色菌落之比约为7：3。从DNA／铀u3AI+pUCl8／BamHI和DNA／PstI+pUCl8／Ps}I转化平板上各挑出约2000个白色菌落于Nc膜上，以地高辛标记的跨膜域序列为探针进行菌落杂交，初步得到20个阳性杂交信号的菌落。对阳性信号菌落的质粒进行Ps#I酶切鉴定后，对杂交信号强的4个菌落的质粒进行测序分析，未获得嗜麦芽黄单胞菌CG样受体的全基因序列。但是，685bp克隆片段与编码组氨酸激酶／反应调节

7、子杂合蛋白的野油菜黄单胞菌XCC2846基因和柑桔黄单胞菌xAc3030基因部分序列有较大的相似性和同源性，表明在嗜麦芽黄单胞菌中存在着编码组氮酸激酶／反应调节子杂合蛋白的基因和功能蛋白。另一375bp片段编码125aa完整ORP与柑桔黄单胞菌铁受体蛋白部分序列有32％相同氨基酸残基，表明嗜麦芽黄单胞菌可能具有编码类似铁受体蛋白的基因和功能蛋白质。为诠释嗜麦博士掌位论文摘要芽黄单胞菌的基因功能，深入了解该菌的遗传、进化和生物学地位提供了实验依据。越来越多的研究表明，LH／CG受体及其配基均具有异质性。因此，我们还对■腰a』tophf]i

8、a配基xCG蛋白的基因多型性进行了研究。根据嗜麦芽黄单胞菌xCG蛋白相对保守的91～193aa残基域的核酸序列设计了一对引物，以Jrealtophilia基因组DNA为模板，PCR扩增得到约500bP和25