嗜麦芽窄食单胞菌生物被膜相关基因的功能基因组学筛选和调控分子机理.pdf

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1、嗜麦芽窄食单胞菌生物被膜相关基因的功能基因组学筛选和调控分子机理康秀敏2015年1月中图分类号：Q599UDC分类号：540嗜麦芽窄食单胞菌生物被膜相关基因的功能基因组学筛选和调控分子机理作者姓名康秀敏学院名称化工与环境学院指导教师张奇钱韦答辩委员会主席陈甫雪申请学位工学硕士学科专业化学工程与技术学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年1月Genome-widescreeningandregulationmechanismofbiofilmrelatedgenesofStenotrophomonasm

2、altophiliaCandidateName：KangXiuminSchoolorDepartment:ChemicalEngineeringandEnvironmentalFacultyMentor:ZhangQiQianWeiChair,ThesisCommittee：ChenFuxueDegreeApplied:MasterofEngineeringMajor：ChemicalEngineeringandTechnologyDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyT

3、heDateofDefence：Jan，2015研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：摘要嗜麦芽窄食单胞菌是一种革兰氏阴性菌，主要感染免疫力缺损或免疫力低下的患者，是一种医源性条件致

4、病菌。其感染可造成严重的脑膜炎、心内膜炎、呼吸道感染及菌血症等。在ICU病房中，其感染后造成的病患死亡率达70%以上，是目前医院感染最重要的病原细菌之一。大多数临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌都易于在生物或非生物体表面形成生物被膜。生物被膜的形成使细菌的生理代谢发生重大变化，从而获得更高的适应性，如获得多重耐药性。但到目前为止，关于嗜麦芽窄食单胞菌生物被膜的分子机制以及形成调控机理的研究还比较薄弱。本研究利用Tn5转座子方法，建立了一个嗜麦芽窄食单胞菌的大规模插入突变体库，以转座子编码的卡那霉素抗性基因筛选阳性克

5、隆，共得到14028个转座克隆。采用结晶紫染色的方法，从中筛选得到74个生物被膜改变的突变体。进一步通过TAIL-PCR技术鉴定突变体侧翼序列发现：除了4个突变体的插入位点位于基因间以及两个多拷贝的插入位点之外，46个基因突变后导致生物被膜发育缺陷。这些基因的功能主要参与鞭毛合成、胞外多糖、嘌呤合成、细胞内氧化还原反应、生物分子转运、基因调控、多肽和脂质合成等。其中，20个基因（43.5%）涉及鞭毛合成的不同阶段及其调控，表明鞭毛对细菌生物被膜的形成起重要作用。在20个鞭毛合成相关的基因中，Smlt2299

6、基因编码一个“孤儿”反应调节蛋白FsnR。表型检测结果表明fsnR基因在生物被膜形成、细菌游动性、细菌鞭毛合成方面发挥了重要作用。通过Semi-RT-PCR的研究发现，除了Smlt0710基因的表达量太低无法检测之外，FsnR作为一个典型的转录因子直接或者间接地调控了其他10个鞭毛相关基因的转录。并且，EMSA结果进一步验证了FsnR至少能够通过结合两个操纵子的启动子区来激活其转录，进而直接调控这些基因的转录。本研究首次构建了嗜麦芽窄食单胞菌的转座子插入突变体库，鉴定了与其生物被膜形成相关的基因，并证明了S

7、mlt2299基因通过调控鞭毛组装进而影响生物被膜形成的分子机理。研究成果为进一步分析该细菌生物被膜的形成与发育过程打下了遗传学基础。关键词：嗜麦芽窄食单胞菌；突变体库；生物被膜；鞭毛；fsnR基因IAbstractStenotrophomonasmaltophiliaisagram-negativebacteriaanditoftencausestheimmunodeficiencyorimmunosuppressedpatientsinfectionincludingrespiratorytract,m

8、eningitis,endocarditisandbacteremia,etc.ThereportedmortalityratesforS.maltophiliainfectedpatientsinintensivecareunits(ICU)ismorethan70%.Ithasbecomeoneofthemostimportantpathogenicbacteriainnosocomialinfection.