超嗜热菌Pyrococcusfuriosus的培养及其α淀粉酶基因的克隆与表达

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1、广西大学硕士学位论文超嗜热菌Pyrococcusfuriosus的培养及其α-淀粉酶基因的克隆与表达姓名：林谦申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：黄日波2003.5.1超嗜热菌Pyrococcusfuriosus的培养及其凹淀粉酶基因的克隆与表达摘要Gc-淀粉酶是最重要的一类工业酶，它们在淀粉加工、酿酒、乙醇生产、纺织和其他工业部门上都有广泛的应用。因为淀粉只在1帅℃或以上才能完全溶于水溶液，大多数应用于工业上的钟淀粉酶都要求能够在极高的温度(可达1佃℃)下使用。f来源于强烈火球菌Pyrococcusfurios

2、us)的甜淀粉酶(PFA)具有应用于工业的潜力，因为其最佳反应温度达1加℃，最佳pH为5．5—6．0，且其活力或热稳定性的维持不需要添加钙离子。Pyrococcusfuriosus的小量培养采用排尽氧气后的Schott试剂瓶，同时不断通入氮气，温度保持在98"C。大量培养则采用10升的高压釜，在严格的厌氧条件下培养52小时。由8升的培养液得到的典型产量为2．49(湿重)。]L一根据GenBank公布的只furiosus的0L．淀粉酶基因amyA序列设计两条引物，以P．furiosus的基因组DNA为模板进行PCR。将P

3、CR产物插入表达载体pSE380和pJL3，得到重组质粒pSE-amyA和pJL-amyA，转化到大肠杆菌DH5ct，Topl0，BL21(DE3)中。将重组菌株分别在29℃和37℃诱导表达，测得最高活力为1．5U／ml(在29"12诱导下)。SDS—PAGE亦显示PFA表达出了活力。在国内未见有该酶的研究报道。关键词超嗜热菌、强烈火球菌、0【一淀粉酶．克晦表达，广日t学嗣±学位论￡CULTIVATIONOFHYPERTHERMOPHILEPyrococcusfuriosus，ANDEXPRESSIONOFITSCLO

4、NEDct-AMYLASEGENEABSTRACTc【-Amylasesareamongthemostimportantcommercialenzymes，havingwideapplicationsinstarch-processing，brewing，alchoholproduction，textile，andotherindustries．Sincestarchstartsbeingsolubleonlyat100。Candabove，themajorityofindustrialapplicationsof0【

5、-amylasesrequiretheiruseattemperaturesofuptollO。C．Theextracellular0【一amylasefromthehyperthermophilicarchaeonPyrococcusfuriosus，PFA，isapromisingcandidateinstarchprocessing，sinceitisoptimallyactiveat100。CandpH5．5-6．0anddoesnotrequireCa“foractivityorthermo—stabilit

6、y．Thehyperthermophilicarchaeont'rococcusfuriosuswascultivatedinanoxygen—freeSchottbottleintegratedwithathermometer,tubesgassingwithnitrogenat98。C．Formassiveculture，a10-·literhigh·-pressurereactorwasemployedtoperformthefermentationunderabsolutelyanaerobicconditio

7、nsfor52hours．Atypicalyieldofcellswas2．49(wetweight)，harvestedfromaworkingvolumeof8liters．TwooligonacleotidesweresynthesizedaccordingtothesequenceofP．fut／osusextracellularQ-amylasegeneamyAthroughtheGenBankandusedasprimersforPCRwithP．fur／osusgenomicDNAasthetemplat

8、e．ThePCRproductwasinsertedtoplasmidspSE380andthenpJL3，yieldingrecombinantspSE-amyA，pJL-amyA．TherecombinantvectorspSE-amyA，pJL-amyAweretransformedintoE．coliDH5cx，Topl0