三种嗜热转氨酶的克隆表达及表征

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1、：１０６９７分类号：Ｑ７学校代码：２０１５２０８７９密级：公开学号ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｉ颀士字位论文ＭＡＳＴＥ＇ＲＳＤｉＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ三种嗜热转氨酶的克隆表达及表征学科名称：生物化学与分子生物学：高文运教授作者：华水红指导老师西北大学学位评定委员会二〇—八年六月摘要摘要ω-转氨酶是一种可用于制备光学纯α-手性胺的工具酶，而大量生物活性化合物或合成前体具有α-手性胺结构片段，因此ω-转氨酶为具有手性胺结构特征的生物活性化合物的不对称合成提供了独特的手段。本研究通过基因工程的方法克隆了三种不同来源的嗜热转氨酶基因

2、，分别来自于海栖热袍菌（Thermotogamaritima）、嗜热链球菌（SphaerobacterThermophilus）和嗜热集胞藻（Thermosynechococcussp.NK55a,TN），将目的基因分别与载体pET30a进行连接后转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，构建可应用于制备耐热转氨酶的工程菌，诱导表达后通过亲和层析纯化的方法得到三种不同的嗜热转氨酶，即重组海栖热袍菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶（AcOAT）、嗜热链球菌ω-转氨酶（ω-TAST）、嗜热集胞藻转氨酶（TATN），经SDS-PAGE分析发现，其中AcOAT和ω-TAST均为可溶性表达，而TATN表

3、达为包涵体形式。分别对两种可溶性表达的转氨酶AcOAT和ω-TAST的酶学性质进行表征。实验结果表明AcOAT和ω-TAST的最适pH均为8.0，但随着pH的变化它们活性的变化趋势不同；它们的最适温度均为60℃，但AcOAT的耐热程度更高，在100℃时仍有活性，而ω-TAST在80℃时就几乎没有活性了；这两种酶的最适2+2+2+2+2++反应时间均为1h。还测定了Zn、Ca、Mg、Fe、Mn、Na这几种金属离子对AcOAT活性的影响，发现均对酶的活性有不同程度的抑制，为研究AcOAT的抑制剂提供了实验基础。由于所检测的ω-TAST的底物大多难溶于水，需要用助溶剂助溶，因此还测定了

4、助溶剂对ω-TAST活性的影响。结果显示当甲醇浓度为10%时，酶活性仅剩10%左右，因此甲醇不适合作为ω-TAST的助溶剂；而对于DMSO来说，当其浓度高达25%左右的时候，ω-TAST仍具有80%以上的活性，因此DMSO可以用作ω-TAST的助溶剂。实验中还测定了AcOAT和ω-TAST的Km值，AcOAT对N-乙酰-L-鸟氨酸的最大反应速率Vmax为32.71μmol/min，Km值为6.7mM；ω-TAST对(S)-α-MBA的最大反应速率Vmax为36.50μmol/min，Km值为1.25mM。进一步，还探讨了两种酶对不同的氨基供体和氨基受体的相对活性大小，表明这两种不

5、同来源的转氨酶对于不同的氨基供体和氨基受体所表现出的活性有较大的差异。关键词：嗜热转氨酶；活性；可溶性表达；酶学性质I西北大学硕士学位论文Abstractω-Transaminasesareapotentialtoolforpreparingopticallypureα-chiralamines.Sincealargenumberofbiologicallyactivecompoundsorsyntheticprecursorshaveα-chiralaminestructuralmoieties,ω-transaminasesofferauniqueopportunityfor

6、theasymmetricsynthesisofbioactivecompoundswithchiralaminesubstructures.Inthisthesis,threethermophilicaminotransferasegenes,separatelyfromThermotogamaritima,Sphaerobacterthermophilus,andThermosynechococcussp.NK55a(TN)wereclonedbymolecularcloning,thetargetgeneswerethenrespectivelyligatedwiththe

7、vectorpET30aandtransformedintoE.coliBL21(DE3)cellstoconstructtheengineeringstrainsthatcouldbeusedtoprepareheat-resistanttransaminases.Afterinducingexpressionandpurificationbyaffinitychromatography,threedifferentthermophilictransaminases,namel