转氨酶BtrR的理性设计及葡聚糖苷酶AcCel16的克隆与表征

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1、分类号：Q55单位代码：10183转转研究生学号：2015342015密级：公开氨酶BtrR的理性设吉林大学计及葡硕士学位论文聚糖苷(学术学位)酶AcCe转氨酶BtrR的理性设计及葡聚糖苷酶AcCel16的克隆与表征l16RationalDesignofAminotransferaseBtrRandCloningand的克CharacterizationofGlucosylaseAcCel16隆与表作者姓名：卜明玮征专业：生物化学与分子生物学研究方向：分子酶学研究卜明指导教师：张作明副教授玮培养单位：生命科学学院吉林2018年5月大学转氨酶BtrR的理性设

2、计及葡聚糖苷酶AcCel16的克隆与表征RationalDesignofAminotransferaseBtrRandCloningandCharacterizationofGlucosylaseAcCel16作者姓名：卜明玮专业名称：生物化学与分子生物学指导教师：张作明副教授学位类别：理学硕士答辩日期：年月日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博士

3、(或硕士)学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希

4、望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。论文级别：■硕士□博士学科专业：生物化学与分子生物学论文题目：转氨酶BtrR理性设计及葡聚糖苷酶AcCel16的克隆与表征作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：吉林省长春市前进大街2699号（130012）作者联系电话：15754309686摘要转氨酶BtrR的理性设计及葡聚糖苷酶AcCel16的克隆与表征糖尿病对人体健康存在极大危害，研究有效的抗糖尿病药物对维持生命活动有深远意义。α-葡萄糖苷酶抑制

5、剂作为一种新型的抗糖尿病药物广泛应用于临床，其具有含氮的拟糖类结构，能抑制糖苷键的形成，减弱α-葡萄糖苷酶活性。Valienamine是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有与α-D-葡萄糖相似的构型。Valienamine在体内的合成途径是一个系列复杂的过程，时间久成本高。最近发现，转氨酶BtrR可以通过转氨反应实现一步合成valienamine。然而野生型的BtrR还存在催化效率低，稳定性差等缺点。生物信息学计算表明，野生型酶BtrR基因92位点的氨基酸对酶活力的大小起着至关重要的作用。为了获得活性较高的转氨酶，本文通过定点突变的方法对野生型酶BtrR92位点

6、的氨基酸进行饱和突变。我们对BtrR及其突变体分别进行了表达、纯化。应用GDH偶联法测定BtrR及其突变体的酶活力。结果表明突变体R的活性高于野生型1.12倍，而其它突变体K，L，M，H，G，A和F的活性较野生型有所降低，其余突变体活性与野生型相似。该结果表明BtrR酶序列的92位点对酶活力有很大影响。我们的研究结果为构建高效的valienamine合成途径奠定了基础。随着地球上可再生资源的逐渐流失，探索可再生能源的开发途径已成为全世界关注的问题。应用纤维素酶催化木质纤维素使之降解，是获得可再生资源的有效途径之一。为了获得高活性和高稳定性的糖苷酶，本文从嗜

7、热酸菌Acidothermuscellulolyticus11B中克隆出葡聚糖苷酶ABK51904.1基因，其属于糖苷水解酶16家族(GH16)。以pET-28a为表达载体，构建大肠杆菌工程菌，可溶性表达后经热处理和镍柱亲和层析得到电泳纯度的重组蛋白AcCel16。酶学性质分析表明，该酶以Laminarin为底物时水解活性最高，其最适pH为5.0，最适温度为55℃，在70℃下孵育1小时后仍能保留60%左右的酶活性。实验发现该酶为非金属离子依赖型酶，其K-1-1m值和Vmax分别为1.92mg·mL和44.6U·mg。实验结果表明该酶具有很好的酸耐受性和热稳

8、定性，此外底物谱比较广，在I生物质利用方面具有应用潜力。关键词：α