咖啡α半乳糖苷酶基因的克隆与表达研究

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1、华南热带农业大学博士学位论文咖啡α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达研究姓名：梁素钰申请学位级别：博士专业：作物遗传育种指导教师：郑学勤2003.5.1咖啡Q一半乳糖静酶基因的克隆与表达研究摘要a．半乳糖苷酶(a—D—galactosidase，a—Gal，Ec3．2，1．22)是一种外切栅营酶，广{慧存在于生物界中．不同来源的n—Gal分子量介予28OOO～370000之问，有单体、二聚体、兰聚体与四聚体形式．由于菜些来源的n·G8l具有血搿转换的特殊功能，对该酶的研究越来越多，从咖啡来源的a—Gal在做璎转换方

2、而的效莱表现最好，目前，采用生物工程手段进行研究融开始为科技界所关注。编码小粒种嘲H镕(CD虎口口阳6耙d)口一G8l静cD黼约为13懿bp，编码377个羝基酸，耨成熬躲编弼K豁cB融鲶菇le鹊bp。壤稻383个氮薹馥。本硬鲣势褰竞隆7大粒秘粕唪(e电琚d，i69，幻口)与中粒手巾期赡《cQ骆#c口"肇^#r8)鳃a一强l戒熟敷缡羁嚣鸵cD姒，嚣怎利用二静微生物表达系统进行鬟级发酵袭然灼蜞究，研究结果如下：1．利用试剂盘的改进方法，简便、快捷而有效地提取到质最照好的热带f1：物咖啡的总RNA，垒过程仅需2h．

3、2．酋次从大粒种咖啡(c，打6e，，c口)与巾粒种咖nm(ccdn印ADr口)中，克降判n—GalcDNA的成熟肽编码区d—Gal-DcDNA和a—GaI-ZcDNA。克隆到的a—Gal-DcDNA编码区为1089bp，与己发表的小粒种咖懦成熟虢编码序列1089bp有98，7诱同源往．筵有l《处碱基发生变仡，氨萋酸发童突变静宵8个{壳淹到鹃a—Gal．zcDNA编码区氇为1089bp．与已发表翡，j、粒释酾皤袋熬敖编码滓穰1089bp存99．27甏弼深赣，箍存8赴碱纂发生交纯，氯基酸发生突变静存4令。3。将毙

4、隆副秘大粒耱与中粒秘期雄黝a—G8l基因，用翳额德毕券氏酵母尹耙☆蛔尹口s，。，妇表达载髂》PlCZaA(分泌甲簿诱导型)霸lpGAPzaA(分泌缎成型)，成功她构建了4个酵母表达载体：妒lczaA／GaI—z，pPIczaA，Gal．D。pGAPzaA，Gal—Z，pGApZqA，Gal-D·4．将克隆到的大粒种咖啡的q—Gal基闽，用犬肠杆菌￡奢枷”，拍拍cD，，的分泌型表达载体pET。22b(+)．成功地构建了1个大肠杆菌表达载体：pET．22，GaI-D。5．对重组Pp日sfDr船工程菌pPIczaA

5、，GaI，D／Gsll5、pPIczaA／Gal．≯，GSIl5、pGAPZaA缁al-D，GSIlS进行了摇瓶发酵装达．对发酵产物进行FsDs．PAGE电泳，得到一条约为40KD的主条带，确诀了ra-Ga{一D写ra，Gal—z均稀列了表达；井对表达产物进行了酶活性梭测，臻粱谣朝了Fa。Gal。D每ra．Gal．z瓣英鸯活性。6．酵毋⋯f：稃菌搦瓶鬣酵采用甲醇诱簿銎载体pPlCzaA时，分泌表达的ra，Ga卜D的酶活在48h湃为19。ll(U，lnl)离子fa．Gal．z在43b瓣必ls。够(u抽1)，骚岛

6、质分泌豢却整ra-G蝴．z建692．5(掰∥L)裹}r《．Ga1．D为504．5(mg怒)。说甥朔毽}不羁种来游瓣a．G8l基霆在同一表达载体申，表达攫鸯差异；在分泌表达巾，潼自凄势泌壁裹，酶活不一定就嶷，二者不成正比。实验中对ra．GaI．D酶活检测在108h村，其溅性W离迭48，22(U，m1)，丽rd．Gal．Z则为18．I8(u，mI)。7．劂一个咖啡种来源的a．Gal基因，在不同的表达载体中表达角=也有萍异．甲醇诱导型载体pPIczdA优予组成型栽体pGAPzdA。8．对P加sfDr缸工程菌pPlC

7、zaA，GaI．D，GSll5进行了发酵罐发酵表达．对发酵产物进杼了sDS-P_AGE电泳，得到一条约为40KD的条带，碲认了r口一G&1．D褥到了表达；并对产物进行酶活健检涮，证明了ra．Gal．转其有酶活性。9．对巨cDff：翻鹜菡pE■22，Gal—p，BL2l踅}行了摇瓶麓簿表达。对发酵产物进行了sDs—PAGE电泳，舀的条带区分不铸茧；并对发酵产物进簿了酶活性检浏，其蠢微蠢酶耀性，谎嘲该表选载体与德主藩瑶靛不逶，a+Ga}+D綦瓣麴表达。关键塌t8一半乳耩营酶eD挂A尧建期螓豆B—O趣型转捷皿口4$

8、f。r括￡#o，fCIoning，Sequence，andExpressionofa-D—GalactosidasefromCoffeeBean(c匆疗鲁口，，6F，，f口＆I[坳口f口疗哆P^D，口)Abstracta—D—galactosidase(a．GaI。E．C．3．2．1．22)isanexo—glycosidase，widelypresentinthebio—resources．The