半矮生型桃f—box基因克隆与表达特征研究

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1、半矮生型桃F—box基因克隆与表达特征研究　　摘要：【目的】研究半矮生型桃‘SD9238’F-box基因的序列特征及F-box基因在新梢生长跃变期的表达与节间伸长的关系，为进一步研究该基因调控半矮生型桃植株生长的分子机制奠定基础。【方法】利用基因克隆和RACE技术获得‘SD9238’F-box基因的gDNA及cDNA序列，并分析该基因的序列特征。采用qRT-PCR分析该基因在新梢生长跃变期的表达水平。【结果】获得F-box基因gDNA全长3650bp，cDNA全长1936bp，GeneBank登陆号为KF0231

2、92。该基因ORF长1509bp编码502个氨基酸，蛋白质分子质量55.984kD。生物信息学分析表明，氨基酸序列具有F-box蛋白家族中LRR的结构特征，与蔷薇科中苹果和草莓的F-box基因同源，相似性达98%。QRT-PCR分析结果表明，F-box基因在节间生长跃变期表达量的动态变化与新梢节间的伸长速率动态变化趋势一致，其基因相对表达量在半矮生型桃中于节间生长跃变点5月22日达到最大值，为第一时期的9.4倍；在普通型桃中同样于5月22日达到基因相对表达量的最大值，但只为第一时期的2.2倍。【结论】获得了‘SD

3、9238’10新梢中F-box基因KF023192的序列全长，并明确了该基因的序列特征。对该基因在新梢生长过程的动态表达分析显示，KF023192可能参与了半矮生桃新梢节间生长的调控。关键词：半矮生型桃；‘SD9238’；F-box；基因克隆；RACE；qRT-PcR中图分类号：S662.1文献标志码：A文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0543-08F-box蛋白因最初发现于细胞周期蛋白CyclinF中而得名[1]，它广泛存在于真核生物中，拟南芥全基因组测序发现了1000多个具有F-box结构域

4、的蛋白[2]。它是一类含有F-box结构域的蛋白家族，基因大小为430～2000bp[3]。其N端通常含有一个由40～50个氨基酸组成的F-box基序，此外，在C端具有一些与蛋白-蛋白相互作用相关的二级结构，如亮氨酸拉链（LRR，Leucine-richrepeat）、WD-4010repeats、锌指结构等，这些蛋白结构域介导了底物的特异性识别。F-box蛋白作为SCF复合体的重要组分，与植物的生长素、赤霉素、乙烯及茉莉酸等植物激素的信号传导有关[4]。如植物中发现的F-box蛋白家族成员TIR1是SCF复合体

5、组分，而SCF复合体SCFTIR通过参与生长素诱导的Aux/IAA蛋白降解，从而解除对ARF转录因子的抑制，进而调控植物的生长[5]。对拟南芥的GA不敏感型突变体gid2进行研究发现，F-box蛋白SLR1可能通过依赖于GA的磷酸化作用经SCF蛋白降解途径正向调控GA的信号传导[6]。此外，李莉等[7]通过对OsF-box基因的RNAi，利用表达载体转化水稻‘日本晴’研究该基因在水稻中的功能，结果显示：植株株高变矮，抽穗期延迟，但上部节间会继续长出叶片和高位分蘖。以上研究表明，F-box蛋白参与了植物的激素信号传

6、导及形态建成等重要的生命活动，可能是调控植株生长的关键因子。‘SD9238’是中国农业科学院郑州果树研究所在育种圃杂种后代中发现的一个半矮生型桃突变体，其树体相对矮小，萌芽率、成枝率较低[8]。该突变体树体仅为普通型的1/2～1/3，节间较短，果枝粗壮而长度适中，年修剪量极小，是调控桃树树势，实现树体有限矮化的理想基因资源。‘SD9238’早期生长缓慢，5月中旬开始进入快速生长期，与普通型桃同时期的持续快速生长截然不同。李钰婷等[9]采用cDNA-AFLP技术在半矮生型桃‘SD9238’的生长跃变期分离得到了F-

7、box的差异表达序列，该基因可能参与了植株的生长调节。因此研究‘SD9238’F-box基因的序列信息及表达特征，可为确定该基因在‘SD9238’节间生长调控中的作用，并为进一步解析其调控半矮生型植株节间的生长机制奠定基础。1材料和方法1.1材料以中国农业科学院郑州果树研究所桃育种圃保存的710a生半矮生型桃‘SD9238’及普通型桃的实生苗为供试材料。取‘SD9238’新生叶片，液氮速冻后保存于-80℃备用；并于2012年4月23日、5月6日、5月20日、5月22日、5月27日及6月8日取半矮及普通型桃当年生新

8、梢茎尖，液氮速冻后保存于-80℃备用。1.2新生枝条生长动态测定选取普通及‘SD9238’各30个新生枝条为样本，分别于新梢茎尖的取样时期以及5月25日和6月12日，对新梢顶芽向下数第4节间进行节间长度测量，求平均值。1.3gDNA全长序列克隆1.4cDNA全长序列的克隆桃茎尖总RNA的提取参考CTAB-LiCl法[11]，样品检测方法与gDNA相同。3′RACE和5′R