糖苷酶的异源表达及酶活表征

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1、：Ｑ９３９单位代码：１０６３６分类号．９，２０１５０１５３００１：密级：公开学号硕士学位论文中文论文题目：糖苷酶的异源表达及酶活表征英文论文题目：Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ论文作者：张鹏飞指导教师一：王丁：微生物学专业名称研究方向：应用微生物学所在学院：生命科学学院０１８年３月２５日论文提交日期：２论文答辩日期：２０１８年６月１日

2、四川师范大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交学位论文《糖苷酶的异源表达及酶活表征》，是本人一在导师王丁教授指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体。，均己在文中以明确方式标明本声明的法律结果由本人承担。本人承诺一：己提交的学位论文电子版与论文纸本的内容致。如因不符而引起的学术声誉上的损失由本人自负６学位论文作者：签字日期：＞处年夕月上］：日学位论文

3、出版授权书本人完全同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》“”（以下简称章程），愿意将本人的硕士学位论文提交中国学术期刊（光盘版）电子杂志社在《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表。《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，在《中国博硕士学位论文评价数据库》中使用和在互联网“”上传播，同意按章程规定享受相关权益。作者签名：Ｊ祕．．年＿日论文题目－＾＜Ｍ４ａ４？２０１

4、８毕业院校：四川师范大学毕业年份：年６月？所在学院：１命名所学专业？恢座匈浮［李李疙说明：本授权书由中国学术期刊（光盘版）电子杂志社保存。糖苷酶的异源表达及酶活表征专业：微生物学研究生：张鹏飞指导教师：王一丁摘要：目的及意义：在时代飞速发展，传统能源日益锐减且价格不断上涨、温室气体大量排放、以及全球气候变化的今天，新型可再生能源产业的兴起和发展迫在眉睫。其中，以农、林业废弃物为主的木质纤维素成为最普遍、储量最丰富的可再生资源，它不仅可以用于畜牧养殖、制备生物燃料及食品添加剂，还应用于工业生产和

5、医疗卫生行业。木质纤维素的合理高效利用不仅能够缓解环境压力，还能够带动经济增长。但是，木质纤维素自身的特性使得其很难彻底分解并充分利用。主要原因如下：1）组成木质纤维素的纤维素、木质素和半纤维素之间紧密联系导致降解不彻底；2）纤维素降解发酵所需的酶产量过低，不能满足工业发展的大量需求；3）单一的糖苷酶降解效率较低。因此，本研究旨在寻找多种高效糖苷酶，对其基因进行密码子优化和改造，以期产生可以大量表达且易于收集和纯化的目标蛋白，并对异源表达所获取的融合蛋白酶进行酶学性质表征。以期达到对木质纤维素的高效利用。材

6、料方法：本文利用分子生物学方法构建目的蛋白的重组表达载体，采用大肠杆菌和毕赤酵母两种异源表达体系作为糖苷酶的异源表达宿主细胞，对几种不同来源的异源表达的糖苷酶进行过表达，以及运用DNS方法对酶的酶学性质进行了详细的表征（最适pH和温度、pH和热稳定性以及二价金属离子的影响）。结果：目标蛋白在异源细胞中均成功表达。三种纤维素酶（pJL-14、pJL-36、A10）、甘露聚糖酶（C6）和果胶酶（pJL-44）的最适反应pH值分别为：5.5、5、4、4和4，均偏弱酸性，在中性及弱碱性的环境中均比较稳定。而最适反应

7、温度及热稳定性存在差异：pJL-14、pJL-36的最适反应温度分别为45℃和40℃，35℃和30℃以下较为稳定；C6的最适反应温度为60℃，40℃以下比较稳定；A10的最适反应温度为80℃，60℃以下较为稳定；pJL-44最适反应温度为60℃，25℃以下稳定存在。可以看出，相同来源的糖苷酶和不同来源的同工糖苷酶热稳定性和最适反应温度均不同。酶在常见的二价金属离子中，Co2+、Mn2+、Fe2+对其酶活均具有明显的促进作用，而Cu2+、Pb2+则具有显著的抑制作用。pJL-44较其它酶略有不同，Ni2+、B

8、a2+对其酶活均具有明显的提高作用，而Cu2+、Mn2+则具有显著的抑制作用。I结论：实验结果表明，这几种糖苷酶是碱稳定性较好的酸性多糖水解酶；各个糖苷酶之间最适反应温度和热稳定性的差异，很可能与来源以及酶结构有关；金属离子对于同工酶的作用效果不同。鉴于这几种酶都具有较好的稳定性，从而具有开发为商品酶的潜力。关键词：发酵比酶活DNS法异源表达糖苷酶IIAbstractHeterologousexpressiono