扩展青霉脂肪酶的异源表达及分子突变

《扩展青霉脂肪酶的异源表达及分子突变》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、福建师范大学硕士学位论文扩展青霉脂肪酶的异源表达及分子突变姓名：邹有土申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：林琳20080501福建师范大学邹有土硕士学位论文摘要扩展青霉脂肪酶(PEL)是一类特殊的酯键水解酶，可在油水界面催化甘油三酯生成脂肪酸和甘油，在工业上起着重要的作用。本研究将扩展青霉脂肪酶基因(1ip07)导入巴斯德毕赤酵母(尸鼬谊p口sfD廊)中，以甘油醛．3．磷酸脱氢酶(G4P)启动子来表达PEL。巴斯德毕赤酵母是一种理想的真核蛋白表达系统，能够稳定高效表达外源蛋白。利用GHP启动子，无需像彳似Z启动子那样，在诱导表达阶段需要剔除非甲醇的碳源，且不以甲醇为诱导物，避

2、免了有毒物质的积累。以葡萄糖或甘油为碳源，重组脂肪酶(PELpo婶zA．1ip07)均得到了表达。通过优化发酵条件，酶活从开始的53．OU／ml提高到了221．5U／fml。本研究还利用定点突变技术对PEL进行了分子突变，共获得了9株脂肪酶突变体。其中PELep8．K202A热稳定性得到很大改善，m值比野生型提高了2．63℃，并具备与野生型相当的脂肪酶表达量。一：PEL基因在巴斯德毕赤酵母中的表达将编码扩展青霉脂肪酶的cDNA(1ip07)克隆到酵母表达质粒pGAPZA，利用zeocin抗性及限制性酶切鉴定筛选重组表达载体pQ廿ZA．1ip07，然后电转化宿主菌毕赤酵母GSll5，以G卯为启动

3、子进行胞外表达。橄榄油鉴定板检验表明重组菌的发酵上清具有脂肪酶活性，SDS．PAGE分析得出重组脂肪酶的分子量约为28KD，与野生型扩展青霉脂肪酶一致，发酵上清液中脂肪酶的含量约占分泌蛋白的95％以上。通过优化发酵条件，结果表明，以甘油作为碳源发酵表达PEL时表达量最高，以橄榄油为底物进行酶活测定，96小时发酵上清的脂肪酶酶活可达到221．5U／ml。二：PEL基因的定点突变为提高扩展青霉脂肪酶的热稳定性，本论文采用重叠延伸PCR的方法对PEL基因进行了多个定点突变，包括在野生型ljp07上的单点突变和在随机突变体ep8(为本课题组构建的热稳定性提高的突变脂肪酶)上的叠加突变。将突变后的PEL

4、基因连接到毕赤酵母表达载体上，并转化进入毕赤酵母GSll5构建突变脂肪酶基因工程茵。在甲醇的诱导下进行突变脂肪酶的表达并测定其对温度的敏感性。(1)l心02A单点突变及叠加突变叠加突变体PEL广ep8．K202A的最适作用温度比野生酶上移了2．0℃，热稳定性(m)比野生型提高2．63℃，比随机突变体PELep8提高了1．21℃。表达量约为福建师范大学邹有土硕士学位论文260．吮咖l，发酵酶活约为504．7U／ml，比活力约为1941．0U／mg；单点突变体PEI，lip07．K202A最适作用温度不变，热稳定性(Z．m)比野生型降低1．95℃，表达量约为125．吮g／ml，发酵酶活约为273．

5、0U／恤l，比活力约为2184．Ou／mg。(2)N73T叠加突变叠加突变体PELep8．N73T最适作用温度比野生型PELlip07降低5℃，热稳定性(m)降低O．55℃，表达量约为40．陬咖l，发酵酶活约为71．OU／ml，比活力约为1775．0U／mg。(3)S153P、Q176P单点突变单点突变体PELlip07．Q176P和PEL广lip07．S153P的热稳定性均下降，z'm值分别为37．81℃和36．36℃，分别比野生型下降了1．22℃和2．67℃。(4)K202E、S91K、H107R、N157Y单点突变单点突变体PELlip07．K202E、PEL广lip07-S91K、PE

6、I厂lip07．H107R及PELlip07．N157Y均不能够在YPOM板上形成透明圈，SDS．PAGE分析亦无脂肪酶目的蛋白，突变体发酵上清不具备脂肪酶活性。关键词：扩展青霉脂肪酶，G_P启动子，表达，突变，热稳定性福建师范大学邹有土硕士学位论文AbstractPP咒记fZ以h聊唧口甩s“小lipase(PEL)plays柚importamroleiIlindust巧foritscatalyticcharaCters．PJ砌肠∥s幻厂西isaVery900deukaryOticexpressionsystemthatc觚stablyexpressheterologousproteinsat

7、higllleVeLExpressionwiththeG么Ppromote“P训ismeth卸ol—freeandsometimestheleVelofexpressioncaIlbesliglltlyhigllerth柚thatobtainedwiththe彳0灯promoter．PELcodinggenewasc10ned柚dintroducediIltoyeastinte伊atiVeplas